Extração, fracionamento e caracterização espectroscopica da materia organica do solo

Abstract

Resumo: A matéria orgânica de dois laíossolos vermelho-escuro, um deles sob campo nativo e outro submetido a um experimento comparativo entre sistemas de preparo do solo de longo tempo (19 anos), incluindo plantio direto, cultivo mínimo e adicionalmente um reflorestamento com Eucalipto, foi extraída por pirofosfato de sódio, fracionada e analisada por cromatografia de exclusão em vidro de porosidade controlada (CE-VPC). Os cromatogramas obtidos foram analisados matematicamente (deconvolução) e a análise estatística dos dados foi feita usando métodos multivariados (análise fatorial e correlação de Pearson). O cultivo levou à uma diminuição no conteúdo de substâncias húmicas, porém não afetou significativamente o conteúdo de C orgânico. O cultivo provocou um aumento na proporção relativa de substâncias húmicas de menor tamanho molecular, determinada por cromatografia, e pela relação ácido fúlvico/ácido húmico. Isto pode ser devido à degradação preferencial de substâncias húmicas grandes ou à neo-síntese de substâncias húmicas pequenas devido à maior entrada de resíduos vegetais, promovida pela fertilização e calagem deste solo inicialmente pobre. O método empregado permitiu a separação do ácido húmico cinza em duas frações distintas, e a fração com maior tamanho molecular apresentou um valor alto, incomum, para a relação E4/E6 que é atribuído à uma pequena conjugação dos anéis aromáticos. As análises por espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (IVTF) das frações cromatográficas obtidas foram dificultadas pelo alto conteúdo de sais inorgânicos provenientes do extrator (pirofosfato) e da solução eluente (borato), porém pôde-se observar que o tratamento ácido das substâncias húmicas até pH 2, procedimento rotineiro no método clássico de extração e fracionamento químico, leva à alterações destas. Desenvolveu-se um novo método para extração e fracionamento físico (cromatográfico) da matéria orgânica do solo utilizando-se resina de troca catiônica após a dispersão dos colóides do solo por vibração ultra-sônica (resina/ultra-som). Este estudo foi feito comparativamente, extraíndo-se a matéria orgânica do solo com pirofosfato, resina e resina/ultra-som. Os extratos foram analisados e fracionados em classes de tamanho molecular, por CE-VPC, utilizando-se uma solução de bicarbonato de potássio a 0,05 mol L-' como eluente. O método para a obtenção do cromatograma em absortividade, estimada pela absorbância no ultravioleta, produziu resultados similares aos de medidas da concentração de C orgânico por técnicas destrutivas apresentados na literatura. O tratamento com ultra-som produziu substâncias húmicas de maior pureza em relação à extração com pirofosfato ou resina sem este pré-tratamento. O pirotostato foi o extrator mais eficiente, seguido por resina/ultra-som e a eficiência deste método aumentou no solo mais argiloso. Os espectros de ultravioleta-visível das duas primeiras frações cromatográficas de maior tamanho molecular, obtidas dos extratos de todas as amostras e extratores estudados, apresentaram bandas largas de absorção centradas em 470 nm que podem ser atribuídas aos compostos do tipo das hidroxiantraquinonas e que contribuíram para o alto valor da relação E4/E6 da fração de maior tamanho molecular, pois nesta fração esta banda foi mais intensa. A extração da matéria orgânica do solo por resina/ultra-som e seu fracionamento cromatográfico é um método adequado para análise e fracionamento das substâncias húmicas em classes de tamanho molecular e o uso de bicarbonato de potássio como eluente, seguido pela transformação deste em cloreto de potássio pela acidificação até pH 4 com ácido clorídrico, evita a contaminação das substâncias húmicas fracionadas com o extrator e o tampão utilizado para a eluição. Logo, análises subsequentes por IVTF e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) das frações cromatográficas são possíveis. As frações do húmus, assim obtidas, apresentaram um alto conteúdo de polissacarídeos e baixo conteúdo de grupos carboxílicos/carboxilato, determinados por IVTF. Nas duas primeiras frações cromatográficas de maior tamanho molecular, caracterizadas pela banda larga centrada em 470 nm, apresentaram, adicionalmente ao sinal típico de semiquinonas, um sinal de RPE com valor g de 1,9989, largura de linha de 16 gauss e que não foi saturado mesmo com 200 mW de potência de microondas. Este sinal pode ser atribuído ao ânion ou cátion radical de hidroxiantrasemiquinonas.

Abstract: The organic matter from two Brazilian Oxisols, one under an Eucalyptus forest and a long term (19 years)cultivated area (minimum tillage and no-tillage) and other soil under natural grassland, was extracted with sodium pyrophosphate, fractionated and analysed by exclusion chromatography on controlled pore glass (CPG). The resulting chromatograms were analysed mathematically (deconvolution) and the statistical evaluation of the data was done using the multivariate method (factor and Pearson correlation analysis). Tillage led to a decrease in the humic substances, but not in the total organic C content. Tillage induced an increase in the relative proportion of humic substances with larger molecular size, determined by chromatography, and for the fulvic acid/humic acid ratio. This can be due to either a preferential degradation of large humic substances or to the neo-synthesis of small humic substances due to the higher fresh-carbon input, promoted by fertilization and liming of this initially poor soil. The used method allowed the separation of gray humic acids in two distinct fractions, and the fraction with the larger molecular size showed an unusual higher E4/E6 ratio, which was explained by a small conjugation of aromatic rings. Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR) analyses of the chromatographic fractions were hindered by the high content of the inorganic salts from the extractor (pyrophosphate) and of the elution solution (borate). Even so it could be observed that the acid treatment of the humic substances up to pH 2, which is a routine procedure in the classic method of extraction and chemical fractionation, led to their alterations. A new method was developed for extraction and physical fractionation (chromatographic) of the soil organic matter extracted by a chelating ion exchange resin after the soil colloids have been dispersed by ultrasonic vibration (resin/ultra-sound). This study was made comparatively, extracting the soil organic matter with pyrophosphate, resin and resin/ultra-sound. The extracts were fractionated according to their molecular size and analysed by CPG using 0.05 mol L-' of potassium bicarbonate solution as eluent. The method for recording the chromatogram of the estimated absorptivity by ultraviolet absorbance yield a similar curve compared to the direct and destructive measuring of organic C as presented in the literature. The ultrasonic treatment produced humic substances of higher purity than the pyrophosphate extraction and the resin extraction without pre-treatment. The pyrophosphate was the most efficient extractor proceeded by resin/ultra-sound, and the efficiency of this method increased in the soil with high clay contents. The ultraviolet-visible spectra of the first two chromatographic fractions of larger molecular size, obtained from the extracts of all the samples and extractors studied, presented broad absorption bands centred in 470 nm. This band can be attributed to compounds like hydroxyanthraquinone and that contributed to the high value of the E4/E6 ratio of the larger molecular size fraction, because in this fraction this band was more intense. The extraction of the soil organic matter by resin/ultra-sound and its chromatographic fractionation is a suitable method for humic substances analyses and fractionation into classes of molecular sizes. The use of KHCO3 solution as eluent, followed by acidification up to pH 4 with HCI solution for transformation into KCI, prevented the contamination of the fractionated humic substances with the extractor and the buffer used for the elution. Therefore, subsequent FTIR and electron paramagnetic resonance (EPR) measurements in the chromatographic fractions are made possible. The chromatographic fractions of the humus presented a high polysaccharide content and low of carboxyl groups, determined by FTIR. The first two chromatographic fractions of larger molecular size, characterized by the broad band centred in 470 nm, showed, additional to the typical sign of semiquinone, a sign in g 1.9989 in the EPR spectrum, with a linewidth of 16 gauss that was not saturated even with 200 mW of microwave power. This sign can be attributed to the anion or cation radical of hydroxyanthrasemiquinone.