Biossurfactantes produzidos por Bacillus sp. : estudos de produção e caracterização

Abstract

Resumo: Biossurfactantes são compostos que possuem aplicações potenciais em muitas áreas, pois são considerados não tóxicos e biodegradáveis, além de exibirem ótimas propriedades de superfície, como abaixamento de tensão superficial (TS) e interfacial (TI) entre duas fases (óleo-água) e excelente capacidade de emulsificação. Biossurfactantes têm composição variada, que depende do tipo de microrganismo, e são produzidos na forma de uma mistura de homólogos, responsável por suas propriedades. Cepas de Bacillus sp. são conhecidas por geralmente produzirem biossurfactantes do tipo lipopeptídeo, sendo o exemplo mais importante desta classe a surfactina, um lipopeptídeo produzido por Bacillus subtillis. Este trabalho teve por objetivo o estudo da produção e a caracterização de biossurfactantes produzidos por cepas de Bacillus sp. utilizando os processos de fermentação submersa (FS) e de fermentação no estado sólido (FES). Inicialmente, para seleção das cepas, foram realizados testes de espalhamento da gota e cultivos para verificação do abaixamento da tensão superficial do meio de cultura em FS. Como não se conhecia a composição do biossurfactante, o acompanhamento das fermentações foi feito inicialmente por diluição micelar crítica (DMC), ou seja, o número de diluições necessárias para se alcançar a concentração micelar crítica (CMC). Nestes ensaios, o melhor resultado foi obtido com B. pumilus UFPEDA 448, utilizando glicerol como fonte de carbono, sendo que em 12 h de fermentação houve redução da tensão superficial do meio de cultura para 28 mN/m, obtendo-se 16 DMC. O biossurfactante contido no sobrenadante de cultura foi capaz de emulsificar a gasolina com elevada estabilidade, com índice de emulsificação, E48, de 54%. Foi avaliado ainda o potencial de produção de biossurfactante por FES utilizando diferentes substratos sólidos, onde os melhores resultados foram obtidos com Okara (resíduo sólido da extração aquosa da soja) e com a mistura de Okara e espuma de poliuretano (9:1, m/m) (32 DMC). As análises estruturais, realizadas por ESI e CG-EM, demonstraram que o biossurfactante produzido por B. pumilus UFPEDA 448 é um lipopeptídeo composto por uma única isoforma, correspondente à Surfactina A, com sete aminoácidos ligados em ciclo na ordem Leu-Leu-Asp-Val-Leu-Leu-Glu, e por cinco homólogos, com variação da cadeia do ácido graxo de 12 a 16 átomos de carbono (C12, C13, C14, C15 e C16), sendo os homólogos C14 e C15 os mais abundantes. Os resultados correspondentes à determinação estrutural da mistura de lipopeptídeos mostraram ainda que as diferentes condições de cultivo levaram à modificação das abundâncias relativas de cada homólogo. Em termos comparativos, a produção de biossurfactantes por FES, por volume de solução umedecedora, foi cerca de 2,4 vezes maior que a produção por FS. A CMC do biossurfactante produzido foi de 5,4 mg·L-1, mostrando sua eficácia, visto que, quanto menor é o valor de CMC, maior a eficiência do biossurfactante. A mudança na composição dos homólogos do biossurfactante não causou modificação nesta propriedade físico-química.

Abstract: Biosurfactants have potential applications in many areas, since they are non-toxic and biodegradable, besides having a good capacity for lowering the surface tension of water or the interfacial tension at water-oil interfaces. They also have an excellent emulsifying ability. Many different biosurfactants are produced, depending on the type of microorganism used. Further, biosurfactants are typically produced as a mixture of homologous compounds. Strains of the genus Bacillus produce lipopeptide biosurfactants, the most important example of this class being surfactin, which is produced by Bacillus subtilis. The present work aimed to study the production of biosurfactants by strains of Bacillus grown in submerged culture and solid-state culture and to characterize the molecules produced. In an initial step for strain selection, the drop colapse method and the decrease of the superficial tension of the supernatants were utilized. Since a method for direct quantification of the biosurfactant had not yet been developed, the culture medium was serially diluted, with the dilution factor required to reach the critical micellar concentration (denominated critical micellar dilution, or "CMD") being used as an indicator of the amount of biosurfactant in the undiluted culture broth. The best result was obtained with B. pumilus UFPEDA 448, using glycerol as the carbon source: after 12 h the surface tension of the culture medium had been reduced to 28 mN/m, with a CMD of 16. The biosurfactant contained in the culture broth gave an emulsification index after 48 h against gasoline of 54%. The potential for the production of this biosurfactant in solid-state cultivation was tested with several solid substrates. The best results were obtained with Okara (solid residue of aqueous extract of soybean) and with a mixture of Okara with polyurethane foam (9:1 by mass). In this case the CMD was 32. Strutural analyses performed by ESI and GC-MS, showed that the biosurfactant produced by B. pumilus UFPEDA 448 is a lipopeptide composed of a single isoform, this isoform corresponding to Surfactin A, with a cyclic peptide of seven amino acids linked in the order Leu-Leu- Asp-Val-Leu-Leu-Glu. There were five homologues of this structure, with variations in the length of the fatty acid, which varied from 12 to 16 carbon atoms (C12, C13, C14, C15 and C16). The homologues C14 and C15 were the most abundant. Different culture conditions led to the production of lipopeptide mixtures with different proportions of these homologues. When compared on the basis of the volume of liquid solution used, the production of biosurfactants by solid-state cultivation led to a yield that was 2.4-fold greater than that obtained in submerged culture. The critical micellar concentration (CMC) of the biosurfactant produced was 5.4 mg·L-1 suggesting that it is an efficient surfactant. The change in the proportions of the homologues did not affect the CMC.