Caracterização funcional das miosinas de classes I e XIII de Trypanossoma cruzi

Abstract

Resumo: O citoesqueleto dos organismos da família Trypanosomatidae é muito pouco estudado. Esta família inclui organismos que causam doenças em humanos, como doença de Chagas e doença do sono – Trypanosoma cruzi e T.brucei, respectivamente – e leishmaniose – causada por diferentes espécies do gênero Leishmania. Microtúbulos são os principais filamentos dos tripanossomatídeos e ainda não foi detectada a presença dos filamentos de actina, embora já tenha sido mostrada a presença desta proteína por imunoensaios. Microtúbulos e filamentos de actina podem funcionar como trilhos para motores moleculares, responsáveis pelo transporte de carga. As miosinas são as proteínas motoras que se movem ao longo dos filamentos de actina e são classificadas de acordo com suas similaridades. Os tripanossomatídeos possuem a miosina de classe I, presente em quase todos os organismos eucarióticos, e uma miosina exclusiva da família, a de classe XIII. A presença desta miosina de tripanossomatídeos é bastante intrigante, principalmente porque pouco se sabe sobre o citoesqueleto de actina destes organismos. Este trabalho visa à caracterização funcional das duas miosinas de T.cruzi comuns aos tripanossomatídeos – myo1 e myo13 – e tem como propostas: verificação da expressão destas proteínas pelo parasita, localização celular e identificação de complexos proteicos ligados às miosinas obtidos por imunoprecipitação, utilizando anticorpos produzidos em camundongos; localização através da expressão da miosina inteira e cauda fusionadas à GFP em T.cruzi; remoção ou inibição da atividade funcional da proteína através de nocaute e ensaio dominante-negativo. Anticorpos foram produzidos em camundongos inoculados com os fragmentos cabeça e cauda das miosinas expressas em E.coli. Os soros produzidos se mostraram específicos para proteínas de tamanho esperado, porém os produzidos contra myo1 reagiram também contra outras bandas. Estes resultados de ligação cruzada podem ser explicados devido à baixa expressão desta proteína pelo parasita, como mostrado em estudos de proteômica e transcriptômica. Resultados de imunofluorescência da myo1 mostraram uma concentração da proteína próxima ao cinetoplasto, podendo ser a bolsa flagelar. Esta localização é semelhante à myo1 de T.brucei, que está envolvida com a endocitose. A imunolocalização realizada com o soro contra a myo13 marcou uma região na base do flagelo, a mesma região da myo13 de L.donovani, que está envolvida na montagem do flagelo. A cauda da myo1-GFP se localizou na mesma região da imunofluorescência, compatível com a bolsa flagelar, indicado que a carga pode ser a responsável pela localização desta miosina. Experimentos estão em andamento para a identificação dos complexos proteicos nos quais as miosinas estão interagindo. A superexpressão da cauda para promoção de um fenótipo dominante negativo não teve efeito morfológico visível a microscópio óptico ou na taxa de replicação de epimastigotas. Estamos trabalhando para a geração de parasitas nocaute. Baseando-se nas localizações e nos trabalhos publicados com T.brucei e L.donovani, sugerimos que a myo1 esteja envolvida com endocitose e tráfego de vesículas, e que a myo13 esteja envolvida com a montagem do flagelo. Assim, com este trabalho, iniciamos a caracterização das miosinas de T.cruzi, o que pode contribuir para um maior conhecimento do processo de transporte intracelular destes parasitas.

Abstract: Cytoskeleton of Trypanosomatidae family organisms is very poorly studied. This family includes some organisms that cause human diseases, like Chagas disease and sleeping sickness – Trypanosoma cruzi and T.brucei respectively – and leishmaniasis – caused by different species from Leishmania genus. Microtubules are the main filament of trypanosomatids and it had not been detected yet the presence of actin filaments, although the presence of this protein has already been shown by immunoassays. Microtubules and actin filaments may function as track for molecular motors, responsible for the cargo transport. Myosins are motor proteins that move along actin filaments and are classified according to their similarities. Trypanosomatids possess class I myosin, present in almost all eukaryotic organisms, and a myosin exclusive of this family, class XIII. The presence of this myosin in trypanosomatids is really intriguing, mainly because little is known about actin cytoskeleton of these organisms. This work aims the functional characterization of the two myosins of T.cruzi common to trypanosomatids – myo1 and myo13 – and has as purposes: to verify these proteins expression by the parasite, to identify cellular localization and proteins that interact with myosins obtained by immunoprecipitation, using antibodies produced in mice; to localize whole and tail myosin fused to GFP in T.cruzi; to remove or inhibit the functional activity of the protein through knock out and dominant-negative assays. Antibodies were produced in mice inoculated with head and tail fragments of myosins expressed in E.coli. Sera produced were specific to proteins with the expected size, although sera produced against myo1 bound to other bands too. This cross-reaction may be explained due the poor expression of this protein by the parasite, as showed in proteomic and transcriptomic studies. Immunofluorescence results of myo1 showed a concentration of this protein near to the kinetoplast, maybe in the flagelar pocket. This localization is similar to T.brucei myo1, which is involved in endocytosis. Immunolocalization made with serum against myo13 marked the proximal region of flagellum, the same localization of L.donovani myo13, which is involved at the flagellum assembly. Myo1-GFP tail localized at the same region of the immunofluorescence, consistent with the flagellar pocket, indicating that cargo may be responsible for the localization of this protein. Experiments are being made to identify protein complexes where myosins can be interacting. Tail superexpression to promote a dominant-negative phenotype did not have morphologic effects visible in optic microscope or at the epimastigotes cellular division. We are working to generate knock out parasites. Based in their localizations and in T.brucei and L.donovani published works, we suggest that myo1 is involved with endocytosis and vesicle traffic, and that myo13 is involved with flagellum assembly. So, with this work we initiated T.cruzi myosins characterization, which may contribute to a better knowledge of the intracellular transport process of these parasites.