Caracterização bioquímica e biológica de fosfolipases presentes em veneno de Loxosceles Intermedia e Lonomia Obliqua

Abstract

Resumo: No Brasil, existem vários animais de importância médica, as aranhas do gênero Loxosceles e as lagartas do gênero Lonomia em especial apresentam índices alarmantes de acidentes com humanos. Esses animais peçonhentos e traumatizantes podem provocar morbidez importante e algumas vezes mortalidade em humanos. Após a picada da aranha marrom (Loxosceles intermedia), as vítimas apresentam lesões cutâneas necróticas ao redor da picada e, em menor freqüência, sinais sistêmicos tais como insuficiência renal, coagulação intravascular disseminada e hemólise. Enquanto, o contato acidental com as cerdas pontiagudas contendo o veneno da lagarta (Lonomia obliqua) leva a dor em queimação, edema, eritema e em alguns casos hemorragias, hemólise e insuficiência renal. Neste presente trabalho, nós caracterizamos bioquímica e biologicamente seis isoformas recombinantes e uma isoforma mutada de fosfolipase-D presentes no veneno de Loxosceles intermedia. O tratamento de eritrócitos provenientes de sangue humano com as toxinas induziu experimentalmente hemólise direta de modo concentração- e tempo-dependentes. Os eritrócitos expostos à toxina fosfolipase-D recombinante apresentaram alterações morfológicas no tamanho e na forma, agregação dos lipid rafts e externalização de fosfatidilserina. A lise direta dos eritrócitos induzida pela fosfolipase-D recombinante depende da espécie do animal testado, já que eritrócitos obtidos a partir de humanos, de coelhos e de carneiros sofreram hemólise em uma porcentagem muito superior do que a observada com eritrócitos de cavalo. Em ensaios de microscopia confocal e imunofluorescência indireta, bem como em citometria de fluxo, utilizando uma toxina fluorescente recombinante GFPfosfolipase- D mostraram a ligação direta da toxina à membrana dos eritrócitos humanos. Além disso, observou-se que está enzima promove a hidrólise de fosfolipídios como a esfingomielina e lisofosfatidilcolina da membrana dos eritrócitos, formando ácido lisofosfatídico e ceramida-1-fosfato respectivamente, que são capazes de ativar uma série de enzimas intracelulares que culminam na morte e ruptura dos eritrócitos. Além disso, o tratamento com a fosfolipase-D recombinante estimula o influxo de cálcio detectado através de uma sonda fluorescente sensível ao cálcio (Fluo-4). Este influxo de cálcio mostrou ser mediado por canais de cálcio do tipo-L. Fazendo o uso de alguns inibidores sugere-se duas possíveis vias que explicam a hemólise induzida pela fosfolipase-D. A primeira através da formação de ácido lisofosfatídico e ativação dos receptores LPA1/LPA3 acoplados a proteína G e a segunda pela formação de eramida-1-fosfato e da sua interconversão em ceramida, esfingosina e esfingosina-1-fosfato. Desse modo, os resultados aqui descritos fornecem evidências de que as fosfolipases-D do veneno de L. intermedia desencadeiam a hemólise direta sobre de eritrócitos humanos de maneira dependente da atividade catalítica e que a ruptura das células ocorre com a formação de metabolitos bioativos que ativam cascatas de sinalização. Por fim, foi clonada uma nova fosfolipase A2 presente nas cerdas de Lonomia obliqua. Esta nova toxina foi parcialmente caracterizada, porém futuramente será feita uma avaliação mais aprofundada das suas características bioquímicas, estruturais e biológicas. Logo, esse estudo sobre as fosfolipases presente nos venenos de Loxosceles intermedia e de Lonomia obliqua pode auxiliar o melhor entendimento dos efeitos fisiopatológicos desenvolvidos nos acidentes com esses animais, assim como para o esenvolvimento de novas manobras terapêuticas e aplicações biotecnológicas e industriais.

Abstract: In Brazil, there are several animals of medical importance, the spider of the genus Loxosceles and caterpillars of the genus Lonomia have particularly alarming rates of accidents with humans. These traumatic and venomous animals may provoke important morbidity and sometimes mortality in humans. After the bite of the brown spider (Loxosceles intermedia), can occur necrotic skin lesions around the bite and,less frequently, systemic signs such as renal failure, disseminated intravascular coag lation and hemolysis. While accidental contact with sharp bristles containing the poison of a caterpillar (Lonomia obliqua) leads to burning pain, swelling, redness and sometimes bleeding, hemolysis and renal failure. In this work, we characterized biochemical and biologically six recombinant isoforms and a mutated isoform of phospholipase-D present in the venom of Loxosceles intermedia. Treatment of ery hrocytes from human blood with toxins experimentally induced hemolysis so concentration-and time-dependent. Erythrocytes exposed to the toxin recombinant phospholipase-D showed morphological changes in size and shape, aggregation of lipid rafts and externalization of phosphatidylserine. The direct lysis of erythrocytes induced by recombinant phospholipase-D depends on the species of animal tested, since red blood cells obtained from human, rabbit and sheep suffered hemolysis in a much higher percentage than that observed with horse erythrocytes. In studies of indirect immunofluorescence and confocal microscopy and flow cytometry, using a recombinant GFP-fluorescent toxin phospholipase-D showed the direct connection of the toxin to the membrane of human erythrocytes. In addition, we observed that this enzyme promotes the hydrolysis of phospholipids such as sphingomyelin and lysophosphatidylcholine erythrocyte membrane, forming ysophosphatidic acid and ceramide-1-phosphate respectively, which are capable of activating a number of intracellular enzymes that culminate in the death and rupture of red blood cells. In addition, treatment with recombinant phospholipase-D stimulates the influx of calcium detected by a calcium-sensitive fluorescent probe (Fluo-4). This influx of calcium was shown to be mediated by calcium channel L-type. Making use of some inhibitors suggests that two possible ways to explain the hemolysis induced by phospholipase- D. The first through the formation of lysophosphatidic acid LPA1/LPA3 and activation of receptors coupled to G protein and second by the formation of ceramide-1- phosphate and its interconversion of ceramide, sphingosine and sphingosine-1- phosphate. Thus, the results described here provide evidence that hospholipase-D from the venom of L. intermedia trigger directly on hemolysis of human erythrocytes in a manner dependent on the catalytic activity and that disruption of the cells occurs with the formation of oactive metabolites that activate signaling cascades. Finally, we cloned a new phospholipase A2 present in Lonomia obliqua bristles. This new toxin has been partially characterized, but the future will be a further evaluation of its biochemical, structural and biological characteristics. Therefore, this study on phospholipases present in the venoms of Loxosceles intermedia and Lonomia obliqua can help better understand the pathophysiological effects developed in accidents with these animals, as well as the development of new therapeutic maneuvers and industrial and biotechnological applications.