Otimizando a detecção e identificação de larvas, sementes e adultos de Crassostrea SPP. (SACCO 1897) através de marcadores moleculares

Abstract

Resumo: A ostreicultura no Brasil depende basicamente do cultivo de tres especies de Crassostrea, Crassostrea rhizophorae e Crassostrea brasiliana, especies nativas, e Crassostrea gigas, uma especie introduzida. A introducao de especies nao-nativas, tal como C. gigas, pode ter consequencias ecologicas e/ou economicas, por isso sua introducao e proibida por leis no pais. Devido as dificuldades na producao de larvas e sementes de ostras nativas em laboratorio, os cultivadores buscam tecnicas que os permitam atender a demanda de sementes para producao. Assim, o objetivo deste trabalho e desenvolver uma ferramenta molecular capaz de detectar larvas de C. rhizophorae e de C. brasiliana em amostras de plancton e identificar sementes das mesmas especies, simultaneamente em uma unica reacao de PCR Multiplex. O protocolo de PCR Multiplex desenvolvido nesse estudo utiliza iniciadores universais para avaliar a integridade da amostra, juntamente com um par de iniciadores especificos para C. rhizophorae, outro para para C. brasiliana. Os iniciadores especificos foram desenvolvidos com base nas diferencas nucleotidicas do DNA de cada especie, resultando em uma amplificacao de fragmentos especificos para cada uma das especies de ostras. O protocolo foi avaliado quanto sua sensibilidade e especificidade, e testados na identificacao de larvas e sementes de ostras na Baia de Guaratuba, Parana, Brasil. O protocolo de PCR Multiplex foi aplicado de Janeiro a Junho de 2010 em 34 amostras de plancton, a fim de testar a aplicabilidade do metodo em detectar e identificar a presenca de larvas das especies-alvo, tambem foi aplicado em 246 sementes, no intuito de testar a capacidade de diferenciacao entre as especies. Os testes realizados, a partir do protocolo de PCR Multiplex, detectaram o DNA de C. rhizophorae em concentracoes baixas de 0.002 ng/ƒÊL, e muito mais baixo de 0.0002 ng/ ƒÊL para C. brasiliana. A PCR Multiplex desenvolvida detectou e identificou com sucesso a presenca de DNA de uma unica larva de cada especie nativa, separadas ou combinadas, quando misturados com o extrato total de DNA de uma amostra de plancton, representando 1000 L de agua filtrada. Das 34 amostras de plancton coletadas, larvas de C. rhizophorae e C. brasiliana foram detectadas no ponto Cabaraquara em todos os meses amostrados, e C. gigas foi detectada nos meses de Janeiro e Abril. Dos 246 individuos coletados, 16% foram identificados como C. brasiliana e aproximadamente 24% foram identificados como C. rhizophorae, 32% foram identificados como Crassostrea sp., mas nao foi identificada como sendo uma das especies-alvo; e 28% das amostras nao foram adequadamente preservadas. Ao testar a especificidade de primers desenvolvidos para a identificacao e prospeccao de C. gigas, as sequencias obtidas da amplificacao de fragmentos do DNA mitocondrial foram submetidas a ferramenta BLAST do GenBank. As sequencias de maior similaridade foram aquelas identificadas como Crassostrea sp., de individuos registrados previamente como uma especie de ostra invasora da regiao Norte do Brasil mas que ainda nao foi formalmente identificada. Assim, amostras positivas para esse marcador podem representar tanto C. gigas ou Crassostrea sp. Para confirmar a especie detectada, no momento, e necessario realizar o sequenciamento do fragmento amplificado. Baseando-se nesses resultados, os iniciadores especificos desenvolvidos para C. brasiliana e C. rhizophorae sao capazes de ser aplicados continuadamente para o monitoramento dos periodos de liberacao de larvas e do ciclo reprodutivo em si. Finalmente, esforcos laboratoriais estao sendo direcionados para definir iniciadores especificos para diferenciar C. gigas de Crassostrea sp. na reacao de PCR Multiplex.