Transcriptômica de Trypanossoma cruzi em resposta a inibidores da síntese de esteróis

Abstract

Resumo: O Trypanosoma cruzi e o protozoario causador da doenca de Chagas, enfermidade que afeta cerca de 15 milhoes de pessoas no continente americano. Diferentemente de mamiferos que sintetizam colesterol, T. cruzi produz principalmente ergosterol, esterol caracteristico de fungos. Por este motivo, a via de sintese deste lipidio representa um potencial alvo quimioterapico da Doenca de Chagas. Dentro de uma etapa inicial do projeto Reguloma de T. cruzi, o presente trabalho teve como objetivo analisar o transcriptoma deste parasita em resposta a duas drogas inibitorias que agem em pontos distintos desta via: Cetoconazol e Lovastatina. Foram calculadas as doses das drogas capazes de inibir o crescimento das culturas celulares em 50% apos 3 dias de exposicao (IC50: 32ƒÊM Cetoconazol e 50ƒÊM Lovastatina); ou matar todas as celulas em 24 horas (DL100: 120ƒÊM Cetoconazol e 100ƒÊM Lovastatina). Foram extraidas amostras de RNA polissomal em tempos precoces de exposicao (30 e 60 minutos) a DL100 (triplicata) e em tempos tardios (1 a 5 dias) a IC50 (duplicata). Os cDNAs gerados a partir das fracoes poli-A+ foram analisados atraves de sequenciamento paralelo massivo (RNA-Seq) com a plataforma SOLiD 3. Foram gerados cerca de 320 milhoes de reads de 50 bases para os experimentos DL100, sendo que a analise dos dados evidenciou quase 3.000 genes diferencialmente expressos em resposta a Lovastatina e cerca de 1.500 frente a Cetoconazol, com FDR menor de 0,1% e foldchange (FC) de 1,5 vez. Analises de enriquecimento de ontologia genica (GO) mostraram que a resposta a DL100 envolve mecanismos estereotipados de expressao genica relacionados a ativacao de vias de catabolismo, principalmente de aminoacidos, e enriquecimento de genes envolvidos na sintese de ATP por fosforilacao oxidativa, alem de uma forte inibicao da sintese e processamento de RNA. Foi evidenciado tambem o aumento da expressao de cisteina-peptidases do tipo Calpaina e Catepsina na resposta a DL100, as quais podem estar envolvidas em morte celular necrotica. Esses resultados sao compativeis com experimentos de microscopia eletronica de transmissao e citometria de fluxo. Para os experimentos IC50, foram gerados cerca de 207 milhoes de reads, selecionando-se 863 genes diferencialmente expressos em resposta a Cetoconazol e 462 em resposta a Lovastatina, com FDR 5% e FC 1,5 vez. Experimentos de microscopia eletronica e de fluorescencia e citometria de fluxo evidenciaram um aumento do numero de reservossomos, enquanto os dados de RNA-Seq indicam o aumento de expressao de possiveis proteinas localizadas nessa organela, apontando para uma possivel funcao dessa estrutura celular na sintese de esterois. Analises de GO demonstraram um enriquecimento de vias envolvidas no transporte de aminoacidos e atividade peptidasica (para genes aumentados) e proteinas nucleossomais (genes diminuidos), alem de respostas droga-especificas. Os dados gerados constituem a primeira avaliacao global da resposta do parasitas a essas drogas, e sua analise em conjunto com os demais ensaios representa uma abordagem riquissima para o entendimento mais aprofundado das modificacoes moleculares que ocorrem com a inibicao da biossintese do ergosterol. Embora a quantidade de dados gerada no presente trabalho nao seja suficiente para analises robustas de reguloma, resultados preliminares demonstram que tal metodologia permite uma compreensao integrada e muito poderosa da biologia basica do Trypanosoma cruzi, principalmente com relacao a mecanismos pos-transcricionais da expressao genica. A inclusao dos dados gerados no presente trabalho na base maior do projeto reguloma representa um importante avanco na identificacao das redes de regulacao da expressao genica.

Abstract: Trypanosoma cruzi is the protozoan that causes Chagas' disease, illness that affects about 15 million people in the Americas. Unlike mammals that synthesize cholesterol, T. cruzi produces mainly ergosterol, sterol characteristic of fungi. For this reason, the route of synthesis of this lipid represents a potential chemotherapic target for Chagas disease. Within an initial phase of T. cruzi Regulome project, the present study aim to analyze the transcriptome of this parasite in response to two inhibitory drugs that act at different points of the ergosterol biosynthesis pathway: ketoconazole and lovastatin. We calculated the drug doses capable of inhibiting the growth of cell cultures by 50% after 3 days of exposure (IC50: 32ìM ketoconazole and 50ìM lovastatin), or kill all cells at 24 hours (DL100: 120ìM ketoconazole and 100ìM lovastatin). Polysomal mRNA samples were extracted at very early exposure times (30 and 60 minutes) to the LD100 (triplicate) and at later times (1 to 5 days) to IC50 (duplicate). The cDNAs generated from poly A+ fractions were analyzed by massive parallel sequencing (RNA-Seq) with the SOLiD 3 platform. We generated about 320 million reads of 50 bases for the DL100 experiments, and the data analysis revealed nearly 3,000 genes differentially expressed in response to lovastatin and about 1,500 compared to ketoconazole, with FDR less than 0.1% and foldchange (FC) of 1.5. Analysis of gene ontology enrichment (GO) showed that the response to LD100 involves a stereotypical expression pattern that include mechanisms related to activation of catabolic pathways, especially amino acids, and enrichment of genes involved in ATP synthesis by oxidative phosphorylation, in addition to a strong inhibition of RNA synthesis and processing. It was also shown increased expression of cysteine peptidases of type calpain and cathepsin in response to LD100, which may be involved in necrotic cell death. These results are consistent with experiments of transmission electron microscopy and flow cytometry. For the IC50 experiments, we generated about 207 million reads, selecting 863 genes differentially expressed in response to ketoconazole and 462 in response to Lovastatin, with FDR 5% and FC 1.5. Experiments of electron and fluorescence microscopy and flow cytometry showed an increased number of reservosomes, while the RNA-Seq data indicate the increased expression of possible proteins located in this organelle, suggesting a possible role of these cell structure in the synthesis of sterols. GO analysis showed an enrichment of pathways involved in amino acid transport and peptidase activity (for increased genes) and proteins nucleosomes (genes decreased), as well as drug-specific responses. The data generated constitute the first comprehensive assessment of the response of parasites to these drugs, and their analysis in conjunction with other tests represents a rich approach to the deeper understanding of the molecular changes that occur through the inhibition of the ergosterol biosynthesis. Although the amount of data generated in this work is not sufficiently robust reguloma analysis, preliminary results show that this methodology allows a very powerful and integrated understanding of the basic biology of Trypanosoma cruzi, mainly in relation to posttranscriptional mechanisms of gene expression. The inclusion of data generated in this study on the larger reguloma base project represents an important advance in the identification of egulatory networks of gene expression.