Respostas celulares de Hepatócitos de Prochilodus Lineatus (Curimbatá) após exposição à Cilindrospermopsina : Sistema de Resistência a Multixenobióticos e Ambiente Redox.

Abstract

Resumo: O aumento das atividades antropogenicas vem sendo causa de uma crescente eutrofizacao dos ambientes aquaticos, levando a floracao de cianobacterias, dentre as quais algumas produtoras de cianotoxinas potencialmente toxicas a vida animal e a saude humana. Desta forma, o estabelecimento de modelos para avaliacao dos principais danos causados pelas toxinas e necessario. Particularmente, modelos in vitro empregando hepatocitos de peixes sao importantes para a investigacao dos mecanismos de toxicidade das cianotoxinas nas celulas. O objetivo do presente estudo foi estabelecer um protocolo para o isolamento e cultura de hepatocitos de Prochilodus lineatus (curimbata), e a partir deste protocolo investigar os efeitos da cianotoxina cilindrospermopsina, atraves da avaliacao da viabilidade celular, sistema redox e de resistencia a multixenobioticos na busca de novas ferramentas na avaliacao deste xenobiotico natural. Os procedimentos empregando EDTA, pancreatina ou tripsina nao foram eficientes para a dissociacao do tecido hepatico. Colagenase IV, colagenase IV+dispase e dispase resultaram, respectivamente, em 1,01x107, 3,58x107, e 6,36x107 celulas.g-1 de figado e viabilidades de 88, 90 e 97%, de modo que o metodo empregando dispase foi selecionado para os testes subsequentes. As microplacas da marca TTPR possibilitaram a melhor adesao celular, e nao houve melhoria evidente desta adesao apos pre-tratamento com colageno I ou matrigel. O periodo de quatro dias foi necessario para recuperacao e adesao das celulas, que puderam ser mantidas por pelo mesmo 7 dias. Apos esta padronizacao, realizaram-se os ensaios toxicologicos. Inicialmente, os hepatocitos foram isolados e cultivados durante os 4 dias pre-estabelecidos. Entao, o meio de cultura foi substituido por novo meio contendo tres concentracoes (0,1 - 1,0 ou 10 ƒÊg.l-1) de cilindrospermopsina purificada. Apos 72 h de exposicao, houve diminuicao na atividade do sistema de resistencia a multixenobioticos (todos os tratamentos), da viabilidade celular (0,1 e 1 ƒÊg.l-1), e atividades de glutationa S- transferase e glicose 6-fosfato desidrogenase (10 ƒÊg.l-1 com relacao as menores concentracoes), aumento dos niveis de especies reativas de oxigenio/nitrogenio (todos os tratamentos) e danos em lipideos (10 ƒÊg.l-1). Nao ocorreram alteracoes na concentracao de glutationa (GSH), na razao 2GSH/GSSG (glutationa dissulfeto), na carbonilacao de proteinas e na fragmentacao do DNA. Sendo assim, os hepatocitos expostos a cilindrospermopsina apresentram uma sensibilizacao significativa, devido principalmente a reducao da capacidade de efluxo de compostos endobioticos e xenobioticos. Alem disso, a toxina apresentou efeitos importantes sobre a sobrevivencia dos hepatocitos em concentracoes mais baixas, enquanto possivelmente ativou mecanismos de protecao no nivel mais alto.

Abstrat: The increase of anthropogenic activities has causing eutrophication of aquatic environments, leading to bloom of cyanotoxins producer cyanobacteria that can thread wildlife and human health. Then, the establishment of models to investigate cyanotoxin effects is necessary, particularly in vitro models utilizing fish hepatocytes to evaluate the mechanisms of toxicity of cyanotoxins and the cell responses. The aim of the present study was therefore to establish a protocol for isolation and culture of hepatocytes from Prochilodus lineatus (curimbata), and to investigate the effects of the cyanotoxin cylindrospermopsin by assessing the viability, redox milieu and multixenobiotic resistance system. The procedures using EDTA, trypsin or pancreatin were ineffective for the dissociation of liver tissue. Collagenase IV, collagenase IV + dispase and dispase resulted, respectively, in 1.01 x107, 3.58 x107, and 6.36 x107 cells.g-1 liver and viabilities of 88, 90 and 97%, so that the method using dispase was selected for the subsequent investigation. The microplate brand TTPR resulted in the best cell adhesion, and there was no apparent improvement of cell attachment after collagen I or matrigel pretreatments. Four days was necessary for cell recovery and adhesion, and cells could be maintained for up to 7 days without reduction of cell viability. After establishment of an appropriated protocol, toxicological investigation was conducted. Initially, hepatocytes were isolated and cultured for 4 days. Then, the culture medium was replaced by fresh medium with three concentrations (0.1 - 1.0 or 10 ƒÊg.l-1) of purified cylindrospermopsin. After 72 h exposure, there were decreases in multixenobiotic resistance system activity (all treatments), cell viability (0.1 and 1 ƒÊg.l-1), and glutathione S-transferase and glucose 6-phosphate dehydrogenase activities (10 ƒÊg.l-1 with respect to lowest concentrations). Conversely, increases in reactive oxygen/nitrogen species production (all treatments) and lipid peroxidation (10 ƒÊg.l-1) were observed. No changes occurred in glutathione (GSH) concentration, 2GSH/GSSG (glutathione disulfide) ratio, in protein carbonylation and DNA fragmentation. In conclusion, hepatocytes may be made sensitive to cylindrospermopsin due to reduction of xenobiotics and endobiotics efflux capacity. Additionally, the toxin presented important effects on hepatocytes survival at lowest concentrations, while activated the protective mechanisms at the highest concentration