Clonagem e expressão heterológa de hialuronidase e alérgeno presentes no veneno de aranha marrom (Loxosceles Intermedia)

Abstract

Resumo: Loxoscelismo é a denominação do quadro clínico provocado em indivíduos picados por aranhas do gênero Loxosceles. No estado do Paraná, os acidentes com este gênero são problema de saúde pública, em especial na cidade de Curitiba e Região Metropolitana, consideradas áreas endêmicas para o loxoscelismo. O veneno de Loxosceles é composto por uma mistura de toxinas de natureza essencialmente protéica, capazes de causar lesões dermonecróticas com espalhamento gravitacional e manifestações sistêmicas tais como agregação plaquetária, anemia hemolítica, falência renal aguda e rash cutâneo. Nos venenos de aranhas do gênero Loxosceles foram descritas toxinas como fosfolipases-D, serinoproteases, metaloproteases, hialuronidases, entre outras. Estudos bioquímicos revelaram a presença de hialuronidases de 41 e 43KDa no veneno de L. intermedia. Hialuronidases são enzimas que degradam componentes da matriz extracelular facilitando a penetração das outras toxinas em tecidos adjacentes ao local de inoculação do veneno, sendo referida como "fator de espalhamento gravitacional". No veneno de L. intermedia outros componentes além da histamina são relatados como responsáveis pela degranulação de mastócitos e pelos eventos inflamatórios. Para melhor compreensão dos quadros loxoscélicos, este trabalho teve como objetivo a clonagem e expressão de duas novas toxinas do veneno de L. intermedia: hialuronidase e alérgeno. Parte da sequência do alérgeno de L. intermedia era conhecida or meio da análise da biblioteca de cDNA da glândula produtora de veneno. Através de técnicas de biologia molecular e desenhando oligonucleotídeos específicos para esta sequência foi possível obter a sequência completa desta toxina, a qual foi subclonada em plasmídeo de expressão pET- 14b utilizando oligonucleotídeos com sítios de restrição para XhoI e BamHI. No caso da hialuronidase, os oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados por meio da análise de sequências de hialuronidase de várias espécies e, com auxílio de técnicas específicas, foi possível obter a sequência completa desta enzima, a qual foi subclonada em pET-14b com auxílio de primers que continham sítios de restrição para as enzimas NdeI e BamHI. Com o teste de indução desta proteína recombinante em cepa E. coli BL21(DE3)pLysS foi padronizado que a condição de expressão desta seria com 0,05mM de indutor (IPTG) por 3,5h. Porém, nas temperaturas de 16ºC a 30ºC a proteína foi expressa e encontrava-se como corpos de inclusão. A expressão em pequena escala com uma cepa alternativa (E. coli AD494(DE3)) demonstrou que na expressão à 30ºC com 0,05mM-0,4mM de IPTG por 5h existe uma fração da hialuronidase recombinante expressa em sua forma solúvel. Os dados do trabalho inauguram a possibilidade de expressão de alérgeno e hialuronidase em grande escala e purificação em cromatografia de afinidade, para que assim sejam realizadas a avaliação de suas atividades biológicas.

Abstract: Loxoscelism is the term used to describe the clinical symptoms evoked in victims of accidents with spiders of the Loxosceles genus. In the State of Parana, accidents involving this genus are a public health problem, especially in the city of Curitiba and metropolitan region, which are considered endemic areas for loxoscelism. Loxosceles venom is a mixture of toxins, essentially proteins, capable of causing dermonecrotic lesions with gravitational spreading and systemic manifestations such as platelet aggregation, hemolytic anemia, acute renal failure and cutaneous rash. Toxins as phospholipases-D, serineproteases, metalloproteases, hyaluronidases, among others were already described in the venom of spiders of the genus. Biochemical studies showed hyaluronidase activities at 41 and 43KDa in Loxosceles intermedia whole venom. Hyaluronidases are enzymes that degrade extracellular matrix components and may act increasing the spread of other toxins in adjacent tissues of the inoculation site of venom. Due to this activity, hyaluronidades are popularly known as "spreading factors". In venom of Loxosceles intemedia other components aside from histamine are reported be responsible for mast cell degranulation and inflammatory events. In order to expand the knowledge of loxoscelism this work has aimed the cloning and expression of two new toxins of Loxosceles intermedia venom: hyaluronidase and allergen. Analysis of cDNA library of L. intermedia venom gland identified a partial sequence encoding an allergen. By means of molecular biology techniques and by designing specific primers for this sequence it was possible to obtain the complete sequence of the allergen, which was then subcloned into the expression vector pET-14b using primers with restriction sites for XhoI and BamHI enzymes. In the case of hyaluronidase, primers were designed by analyzing the sequences of hyaluronidases from several species. Then, using specific techniques it was possible to obtain the full sequence of this enzyme, which was cloned with primers with restriction sites for NdeI and BamHI enzymes. After induction trials for this recombinant protein in E. coli BL21(DE3)pLysS it was standardized an expression condition of 0,05mM IPTG during 3,5h. However between 16ºC-30ºC temperatures the protein was expressed in the form of inclusion bodies. A small scale expression in a different strain (E. coli AD494(DE3)) using induction parameters of 0,05mM-0,4mM of IPTG during 5h at 30ºC resulted in part of recombinant hyaluronidase in the soluble form. The data of this work give conditions for expression of hyaluronidase and allergen in large scale as well as purification in affinity chromatography so that will allow the evaluation of their biological activities.