Cryptosporidium spp. : desenvolvimento de técnicas moleculares e imunoquímicas para a detecção de oocistos em água e avaliação da sua remoção pelos métodos convencionais de tratamento da água

Abstract

Resumo: Cryptosporidium é um patógeno emergente responsável por um grande número de surtos de diarreia em humanos em todo o mundo. Entretanto, a ocorrência de surtos epidêmicos no Brasil é pouco onhecida. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo padronizar técnicas de detecção de Cryptosporidium sp. em água e avaliar sua presença em água usada para o abastecimento público da região metropolitana de Curitiba, Paraná. Duas metodologias foram desenvolvidas e/ou padronizadas para atender a esse objetivo. A primeira foi a técnica de PCR, quando foram testadas quatro técnicas de extração de DNA e comparada a eficiência de cinco pares de primers. O melhor resultado obtido para a extração de DNA foi o que utilizou o kit comercial, associado à nested PCR sendo capaz de detectar DNA do parasito em água com apenas dois oocistos. Anticorpos policlonais anti- Cryptosporidium sp. foram produzidos em coelhos e conjugados com isotiocianato de fluoresceína para realização da imunofluorescência direta. Os nimais tiveram uma boa resposta imune e o conjugado produzido foi utilizado com sucesso, sendo capaz de detectar até cinco oocistos/"poço" que corresponde a uma contaminação de 250 oocistos/mL. adronizadas as técnicas, foi necessária a realização da contaminação experimental da água em escala laboratorial através do jar test para testar essas metodologias. Seis litros de água bruta, provenientes da stação de tratamento de água Iguaçu (ETA Iguaçu) foram contaminados com oocistos de Cryptosporidium parvum nas concentrações de 0,1 a 100 oocistos/mL e três coagulantes com diferentes concentrações foram testados nos ensaios. Em todos os experimentos foi possível encontrar oocistos após a filtração, demonstrando uma inabilidade dos processos convencionais de tratamento da água em remover oocistos de Cryptosporidium. Após as metodologias serem testados em escala laboratorial, amostras de água e de lodo da água provenientes de quatro estações de tratamento de água da região metropolitana de Curitiba oram colhidas, quinzenalmente, durante dois meses e meio e testadas para a presença de oocistos de Cryptosporidium. Em duas estações e em três coletas diferentes foi possível detectar Cryptosporidium sp. pela técnica de PCR. Os resultados desses experimentos mostraram que essas metodologias podem ser utilizadas com segurança na detecção de Cryptosporidium em água e apresentam um baixo custo para a sua realização.

Abstract: The present work aimed at standardizing the techniques for detecting Cryptosporidium sp. in water and assess its presence in water used for public supply in the metropolitan area of Curitiba - Brazil. Two ethodologies were developed and/or standardized to attain that goal. The first one was the PCR technique, with which four methods for DNA extraction were tested, and five pairs of primers were compared. The best result was obtained by using the commercial kit for DNA extraction, coupled with the nested PCR, which was able to detect the parasite’s DNA in water with as few as two oocysts. Anti-Cryptosporidium sp olyclonal antibodies were produced in rabbits and conjugated with fluorescein isothiocyanate to perform direct immunofluorescence. The animals presented a good immune response and the conjugate produced was used with success, for it was able to detect up to five oocysts/well, which corresponds to a contamination of 250 oocysts/mL. After having standardized the techniques, it was necessary to perform xperimental water contamination at laboratory scale by the jar test to assess these methods. Six liters of raw water from the Iguaçu water treatment plant (Iguaçu WTP) were contaminated with Cryptosporidium arvum in concentrations from 0.1 to 100 oocysts/mL; and three coagulants in different concentrations were tested in the trials. In all experiments, oocysts could be found after filtration, showing the incapacity of conventional water treatment processes to remove Cryptosporidium oocysts. After the methods had been tested at lab scale, water samples were collected from four water treatment plants in the metropolitan area of Curitiba every two weeks for two and a half months, and tested to detect the presence of Cryptosporidium oocysts. In two plants and in three different collections it was possible to detect Cryptosporidium sp. by the PCR technique. The results of these experiments showed that these methodologies can be used safely for detecting Cryptosporidium oocysts, and proved to have a low implementation cost.