Clonagem, expressão e purificação de uma proteina da superfamilia TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) a partir de biblioteca de cDNA da glandula produtora de veneno de aranha-marrom(Loxosceles intermedia)

Abstract

Aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas como aranhas-marrons, são responsáveis por acidentes em todo o mundo, com grande importância clínica no Sul do Brasil. Os venenos destas aranhas são compostos por diversas toxinas, entre elas proteínas, responsáveis pelo quadro conhecido como loxoscelismo, que se manifesta em sintomas cutâneos e/ou sistêmicos. O quadro cutâneo é o mais comum e pode levar ao desenvolvimento de uma lesão necrótica com espalhamento gravitacional, resultado de uma inflamação exacerbada que envolve a participação de mastócitos e eventos histaminérgicos. Na biblioteca de cDNA da glândula de veneno de Loxosceles intermedia foi identificada uma seqüência que codifica uma proteína da superfamília TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein). As funções desta proteína ainda não são totalmente entendidas, mas demonstrou-se que ela atua no ambiente extracelular como um fator de liberação de histamina e está ligada a respostas alérgicas em indivíduos parasitados por nematódeos e protozoários. O alinhamento da proteína TCTP de L. intermedia com homólogas de outros organismos revelou um alto grau de conservação da proteína, especialmente em resíduos de aminoácidos relacionados com a interação com GTPases monoméricas. A análise filogenética mostrou que a proteína de L. intermedia esta agrupada com proteínas TCTP presentes na saliva de carrapatos e para as quais já foi demonstrada a atividade de liberação de histamina. Para investigar a função desta proteína no veneno de aranha-marrom, foi realizada a clonagem do cDNA que codifica a proteína em pET 14b e a expressão da proteína recombinante em Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. A TCTP recombinante foi expressa como uma proteína fusionada com um His-Tag N-Terminal. A purificação envolveu dois passos de cromatografia, o primeiro em resina Ni2+-NTA agarose e o segundo em resina DEAE-Agarose. Com a proteína recombinante purificada foram produzidos anticorpos utilizados em um ensaio de Western Blot que evidenciou a presença da proteína TCTP no veneno de L. intermedia. Os dados do trabalho sugerem que a proteína possa estar envolvida nos efeitos nocivos do veneno de aranha-marrom, sendo necessários ensaios biológicos para avaliar a atividade desta proteína no veneno e seu possível papel como um fator de liberação de histamina.

Loxosceles genus spiders, known as brown spiders, are responsible for accidents all over the world and have clinical importance in the South of Brazil. The venom of these spiders is made up of several toxins, including proteins, which are responsible for the clinical pattern called loxoscelism, which involves cutaneous and/or systemic symptoms. Cutaneous reactions are more frequent and may lead to the development of a necrotic lesion with gravitational spreading, resulting from a dysregulated inflammatory response that involves the participation of mast cells and histaminergic events. On the cDNA library of Loxosceles intermedia venom gland was identified a sequence encoding a protein of the TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) superfamily. Functions of this protein are still unclear, but it was shown that it can act as a histamine releasing factor in the extracellular environment, being related to allergic responses in patients parasitized by nematodes and protozoan parasites. Sequence alignment of L. intermedia TCTP protein with homologous in other organisms revealed a high degree of conservation, specially in amino acids residues related to the interaction with monomeric GTPases. Phylogenetic analysis showed that L. intermedia TCTP protein is grouped with proteins that are present in tick’s saliva and for which was demonstrated the activity of histamine releasing. To study the function of this protein in the venom of brown spiders, the cDNA that codes the protein was cloned into pET 14b and the expression of the recombinant protein was carried out in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. TCTP recombinant protein was expressed as a fusion protein with an N-Terminal His-Tag. Protein purification had two chromatographic steps, the first in Ni2+-NTA agarose resin and the latter in DEAE-Agarose resin. With the purified recombinant proteins, antibodies were produced and used in a Western Blot assay that showed the presence of TCTP protein in L. intermedia venom. The data of this work suggest that the protein is involved in the noxious effects of brown spider venom and biological assays are necessary to evaluate the activity of this protein in the venom, as well as its role as a possible histamine releasing factor.