Metaloproteases do tipo astacinas são uma família de toxinas conservadas em venenos de diferentes espécies de aranhas marrons (gênero loxosceles)

Abstract

Resumo

Resumo: No estado do Paraná, os acidentes com aranhas marrons (gênero Loxosceles) são problema de saúde pública, em especial na cidade de Curitiba e Região Metropolitana que são consideradas áreas endêmicas para o loxoscelismo. O veneno de Loxosceles é composto por uma mistura de toxinas, na sua maioria protéica, capazes de causar lesões dermonecróticas com espalhamento gravitacional e manifestações sistêmicas como agregação plaquetária, anemia hemolítica e falência renal aguda. Nos venenos de aranhas do gênero Loxosceles foram descritas toxinas como fosfolipases-D, hialuronidades e metaloproteases, entre outras. As metaloproteases já foram descritas em venenos de diferentes espécies, como exemplo: L. intermedia, L. reclusa, L. deserta, L. rufescens, L. gaucho e L. laeta e acredita-se que tenham participações nos distúrbios hemostáticos descritos após o envenenamento, além de poderem ser um fator de espalhamento das demais toxinas do veneno devido sua ação proteolítica frente aos componentes da matriz extracelular. As espécies de maior importância clínica são: L. intermedia, L. laeta e L. gaucho, sendo a espécie L. intermedia de maior distribuição no estado do Paraná e a principal espécie relacionada com acidentes no município de Curitiba. Através de técnicas de biologia molecular, foi mostrado que uma metaloprotease presente no veneno de L. intermedia (a LALP1 - Loxosceles Astacin-like Protease) pertence à família das astacinas, diferente das metaloproteases de venenos de outros animais, como as de serpentes que pertencem à família das adamalisinas. A LALP1 foi a primeira enzima da família das astacinas descrita como constituinte de venenos animais. O presente estudo identificou, através de análise de diferentes clones de uma biblioteca de cDNA de glândulas de veneno de L. intermedia, duas novas isoformas de astacinas presentes no veneno de L. intermedia, denominadas LALP2 e LALP3. Os imunoensaios realizados com venenos das outras duas principais espécies do Paraná, L. laeta e L.gaucho, mostraram a existência de proteínas nativas relacionadas à LALP1 e que tais proteínas apresentavam atividade gelatinolítica que foi inibida por 1,10- fenantrolina (quelante de metal divalente), confirmando atividade metaloproteásica. Extrações de RNA total de glândulas de veneno de L. laeta e L. gaucho foram realizadas, os cDNAs obtidos utilizando oligonucleotídeos iniciadores para sequência da LALP1 foram sequenciados e identificou-se que esses cDNAs codificavam metaloproteases da família das astacinas, tais proteínas foram denominadas LALP4 (astacina de L. laeta) e LALP5 (astacina de L. gaucho). O alinhamento das sequências aminoacídicas de todas as LALPs e membros da família das astacinas de diferentes organismos mostraram que as astacinas de Loxosceles têm maiores identidades com as astacinas de nematódeos. Portanto, os resultados sugerem a existência de uma família gênica para astacinas no veneno de L. intermedia com expressão de diferentes isoformas (LALP1, LALP2 e LALP3),essa família gênica está presente nos venenos das três espécies estudadas (L. intermedia, L. laeta e L. gaucho) e possivelmente serão encontradas distribuídas em todo o gênero Loxosceles. Esses achados reforçam a relevância biológica das astacinas como toxinas importantes nos efeitos tóxicos dos venenos loxoscélicos

Abstract: In the Parana State, accidents involving brown spiders (Loxosceles genus) are a public health problem, especially in the city of Curitiba and metropolitan region that are considered endemic areas for loxoscelism. Loxosceles venom is a mixture of toxins, mostly protein, capable of causing dermonecrotic lesions with gravitational spreading and systemic manifestations such as platelet aggregation, hemolytic anemia and acute renal failure. In Loxosceles spider venoms were described toxins as phospholipase D, hyaluronic acid, and metalloproteases, among others. Metalloproteases have been described in venoms of different species, for example: L. intermedia, L. recluse, L. deserta, L. rufescens, L. gaucho and L. laeta and is believed to be involved in hemostatic disorders described after poisoning, and can act as spreading factor for other venom toxins, due to its proteolytic action against extracellular matrix components. Species of greatest clinical importance are: L. intermedia, L. laeta and L. gaucho. In the Parana State, L. intermedia species show larger distribution and are the main species related with accidents in the city of Curitiba. By molecular biology techniques, it was demonstrated that metaloprotease from L. intermedia (LALP1 – oxosceles Astacin-like Protease) venom belongs to the astacin family, that is different from others animal venoms metalloproteases, such as snake metalloproteases that belong to the adamalysin family. LALP1 was the first astacin described as an animal venom constituent. The present study identified, by analyzing distinct clones from L. intermedia venom glands cDNA library, two new astacin isoforms present in L. intermedia venom, which were named LALP2 and LALP3. Imunoassays with L. laeta and L. gaucho venoms (two others important species in Parana) showed the existence of native proteins related to LALP1 and these proteins have gelatinolytic activity which could be inhibited by 1,10- phenanthroline (divalent metal chelator), confirming metalloprotease activity. Moreover, total RNA from L. laeta and L. gaucho venom glands were extracted, the cDNAs obtained using LALP1 primers were sequenced and the results identified that they encode metalloproteases from astacin family, named LALP4 (L. laeta astacin) and LALP5 (L. gaucho astacin). Amino acid sequences alignment with LALPs and other astacin members from different organisms showed that Loxosceles astacins have the greatest identities with nematode astacins. Therefore, the results suggest the existence of an astacin gene family in L. intermedia venom expressing different isoforms (LALP1, LALP2 and LALP3), that this gene family is present in venoms of the three species studied (L. intermedia, L. gaucho and L. laeta) and possibly will be found distributed throughout the Loxosceles genus. These findings reinforce the biological relevance of astacin toxins as important for toxic effects of loxoscelic venoms.