Diagnóstico imunológico, histopatológico e molecular das subespécies do Complexo Mycobacterium tuberculosis em amostras de bovinos da região centro oriental do Paraná, Brasil

Abstract

Resumo: A tuberculose é uma doença infecto-contagiosa de abrangência mundial que afeta seres humanos e diversas espécies de animais. A principal espécie de microorganismo infectante dos bovinos é Mycobacterium bovis, que pelo número de casos, é uma manifestação endêmica no Brasil e causa prejuízos econômicos porque interfere na redução da produtividade do rebanho e perdas de carcaças no frigorífico. Ainda, por se tratar de uma zoonose, M. bovis pode infectar seres humanos, causando uma doença clinicamente e patologicamente indistinguível da infecção por M. tuberculosis. Apesar da falta de informações e da importância da tuberculose bovina para a saúde da população, o aumento do número de pacientes imunossuprimidos no país, principalmente pelo vírus da imunodeficiência humana, causa preocupação em relação às doenças causadas por espécies atípicas. Um total de 35 bovinos reagentes, ou indeterminados e negativos à prova de tuberculinização foram utilizados, tendo amostras de tecidos colhidas no momento do abate. Em relação à prova de Tuberculina 48,57% (17/35) dos animais foram diagnosticados positivos para Tuberculose, 22,86% (8/35) apresentaram resultado inconclusivo e 28,57% (10/35) apresentaram resultado negativo. Do total de bovinos examinados, 85,71% (30/35) apresentaram lesão macroscópica sugestiva de tuberculose. Na avaliação microscópica (Citologia) 60,00% (21/35) apresentaram características de algum tipo de lesão. Na avaliação histopatológica, 40,00% (14/35) dos animais apresentaram lesões granulomatosas características de tuberculose, onde foram visualizados Bacilos Álcool Ácido Resistentes (BAAR). Com a interposição destes dados obtemos que dos 17 animais positivos para prova da tuberculina 58,82% (10/17) animais não apresentaram lesão característica de tuberculose com a presença de BAAR, 88,23% (15/17) tinham lesão macroscópica sugestiva de tuberculose e 52,94% (9/17) apresentavam algum tipo de lesão microscópica. Para a análise molecular foi utilizada a metodologia de análise do gene, que codifica a subunidade da RNA polimerase (rpo). Foram selecionadas as amostras dos linfonodos carotídeos para desenvolver esta metodologia. O seu DNA foi extraído em dois momentos. O primeiro momento foi sem o isolamento da cultura, sendo extraído DNA do tecido intacto através da técnica de FenolClorofórmio. Nesta análise não foi possível a amplificação do DNA, fato este esperado pela dificuldade de se obter quantidade de DNA suficiente para amplificação na metodologia de PCR. O segundo momento foi feita a extração de DNA das amostras que obtiveram crescimento no meio de cultura Lowenstein-Jensen (amostra 35) e Stonebrink (amostras 1, 2 e 5). O produto desta PCR foi purificado e encaminhado para o seqüenciamento, usando as metodologias descritas no ponto 4 desta dissertação. O seqüenciamento da amostra 1 mostrou um fragmento com 746 nucleotídeos, a amostra dois 728 nucleotídeos, a amostra 5 743 nucleotídeos e a amostra 35 apresentou um fragmento de 742 nucleotídeos. Quando realizamos as análises pelo programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) obtemos para todas as amostras o mesmo resultado. Isto demonstra que a utilização do gene rpo para a caracterização de subtipos de M. bovis nesta região não é recomendada.

Abstract: Tuberculosis is an infectious disease of world-wide that affects humans and several species of animals. The main species of microorganism infecting animals is of Mycobacterium bovis, that the number of cases, is a manifestation endemic in Brazil and causes economic losses because it interferes with reduced productivity and loss of livestock carcasses in the refrigerator. Still, because it is a zoonosis, M. bovis can infect humans, causing a disease clinically and pathologically indistinguishable from infection by M. tuberculosis. Despite the lack of information and the importance of bovine tuberculosis to the health of the population, the increasing number of immunocompromised patients in the country, especially the human immunodeficiency virus, causes concern about the diseases caused by atypical species. A total of 35 cattle reagents, negative or indeterminate and the tuberculin test were used, and tissue samples taken at slaughter. The animals examined, 85.71% (30/35) showed gross lesions suggestive of tuberculosis. On microscopic evaluation (cytology) 60.00% (21/35) showed characteristics of some type of injury. In histopathological evaluation, 40.00% (14/35) of the animals showed granulomatous lesions characteristic of tuberculosis, which were visualized acid resistant bacilli (AFB). In relation to the test 48.57% (17/35) of animals were diagnosed positive for TB, 22.86% (8 / 35) had inconclusive results and 28,57% (10/35) tested negative. With the filing of these data we obtain from the 17 animals positive for the tuberculin 58.82% (10/17) animals showed lesions characteristic of tuberculosis in the presence of AFB, 88.23% (15/17) had macroscopic lesions suggestive tuberculosis and 52.94% (9 / 17) had some type of microscopic damage. For molecular analysis we used the methodology of analysis of the gene, which encodes the subunit of RNA polymerase (rpo). We selected the samples of lymph carotid to develop this methodology. His DNA was extracted in two stages. The first time was without the isolation of the culture, and extracted DNA from intact tissue using the technique of phenol-chloroform. This analysis was not possible to amplify the DNA, a fact expected by the difficulty in obtaining sufficient quantities of DNA for amplification in PCR methodology. The second time was made to extract DNA from samples obtained through growth in Lowenstein-Jensen culture (sample 35) and Stonebrink (samples 1, 2 and 5). The product of this PCR was purified and sent for sequencing using the methods described in chapter 4 of this dissertation. The sequencing of sample 1 showed a fragment with 746 nucleotides, the sample two 728 nucleotides, the sample 5 743 nucleotides and sample 35 showed a fragment of 742 nucleotides. When we perform the analysis by BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) to get all the samples the same result. This demonstrates that the use of gene rpo characterize subtypes of M. bovis in this region is not recommended.