Expressão genica diferencial em ostras Crassostrea gigas expostas a esgoto doméstico

Abstract

O lançamento de esgoto doméstico em águas superficiais é a principal causa de poluição dos ecossistemas aquáticos ao redor do mundo. O esgoto contém contaminantes diversos como produtos de higiene pessoal, limpeza doméstica, medicamentos humanos e veterinários, óleos e graxas, químicos diversos, além de microorganismos patogênicos e nutrientes em excesso. O contato destes compostos com a biota provoca alterações causando dano e ativando os mecanismos de defesa. A análise da expressão de diferentes genes simultaneamente em um organismo exposto à presença de um contaminante pode auxiliar o entendimento dos mecanismos de toxicidade e defesa biológica, além de contribuir como biomarcador de contaminação em programas de monitoramento ambiental. No presente trabalho, após um período de 10 dias de aclimatação, ostras adultas da espécie Crassostrea gigas (n=10) foram expostas a 33% de esgoto doméstico não tratado por 48h, em aquários de 45L sob condições controladas. Através da técnica de hibridização subtrativa supressiva a expressão diferencial de genes em pool de brânquias de cinco ostras macho foi investigada, sendo obtidos inicialmente 61 clones, dos quais 15 foram identificados. Cinco genes associados a mecanismos de biotransformação de xenobióticos foram escolhidos para confirmação da indução da expressão por RT-PCR semi-quantitativo, normalizado pela expressão do gene da Actina. Esses genes são responsáveis por reações de biotransformação de fase I (CYP356A1), fase II (GSTO), fase III (MDR), transporte de ácidos graxos e compostos hidrofóbicos (FABP) e síntese do grupo heme (ALAS). Todos os genes apresentaram maiores valores de expressão (1,9, 3,3, 3,3, 43,6 e 2,9x para CYP356A1, GSTO, MDR, FABP e ALAS, respectivamente) nas ostras expostas ao esgoto quando comparadas ao grupo controle. Para verificar a aplicabilidade da análise em programas de biomonitoramento in situ, as ostras foram transplantadas para locais referência e contaminados por esgoto doméstico, assim permanecendo por 14 dias. A análise da expressão gênica em brânquias e glândula digestiva das ostras expostas in situ a esgoto doméstico não apresentou diferenças significativas entre os grupos, provavelmente devido ao período de exposição, considerado muito longo para análises moleculares.

The mais cause of surface waters contamination around the world is untreated sewage delivery. Sewage contains several kinds of contaminants like personal care and house cleanning products, human and pet medicines, oils and other chemicals besides patogenic microorganisms and nutrients in excess. The contact of these contaminants with the organisms may cause harm and activate defense mechanisms. The analysis of several genes in the same time in a contaminant stressed organism may contribute to elucidate toxicity and biological defense mechanisms and be usefull as a biomarker in environmental monitoring programs. In this work, after a 10 days acclimatation period, adult crassostrea gigas oysters (n=5) were exposed to 33% of untreated sewage for 48h, in 45L aquariums under controlled conditions. Differential gene expression in pooled gills of male oysters were investigated through supressive subtractive hibridization. From the sixty-one clones obtained 15 were iddentified. Five genes associated with biotransformation of xenobiotics were submited to semiquantitative RT-PCR normalized with actin to confirm the induction in gene expression by sewage. These genes are responsable for fase I (CYP356A1), fase II (GSTO) and fase III (MDR) of xenobiotics biotransformation, fatty acid and hidrofobic compounds transport (FABP) and the heme group synthesis (ALAS). All the analysed genes showed higher values of gene expression (1,9, 3,3, 3,3, 43,6 and 2,9x for CYP356A1, GSTO, MDR, FABP and ALAS, respectively) in sewage exposed oysters compared to control group oysters. To verify the applicability of this kind of analysis in biomonitoring programs, oysters were transplanted to sewage contaminated and reference sites for 14 days. Gene expression analysis in gills and digestive glands of in situ sewage exposed oysters did not show significative differences between the groups, probably because the exposition period was to long for molecular analysis.