Genomica funcional da neurovirulência por vírus dengue sorotipo-1 em modelo murino

Abstract

O vírus da dengue (DENV) causa uma doença febril, conhecida com febre da dengue (FD), que pode evoluir para um quadro hemorrágico seguido ou não de choque, conhecidos como, febre hemorrágica da dengue (FHD) ou síndrome do choque da dengue (SCD). Recentemente, o perfil clínico da infecção pelo DENV vem mudando, e manifestações neurológicas têm se tornado freqüentes. Objetivando determinar o papel de fatores virais e do hospedeiro na patogênese da neurovirulência pelo DENV, nós caracterizamos as cepas FGA/89 (parental) e FGA/NA a5c (neurovirulenta), a nível biológico e molecular. Adicionalmente, nós estudamos a resposta do tecido nervoso, através da avaliação da modulação da expressão gênica em camundongos suíços infectados com ambas as cepas. Foi demonstrado que a cepa FGA/NA a5c apresenta duas mutações na proteína E (Met196/Val e Thr276/Pro), e uma na porção helicase da NS3 (Leu435/Ser). Estas mutações podem estar implicadas na aquisição do fenótipo de neurovirulência em modelo murino. Foi ainda demonstrado que os animais infectados com a cepa FGA/NA a5c desenvolvem sinais de encefalite por volta do 10° dia pós-infecção (dpi), e evoluem para óbito com sinais de encefalite com 13,1 dpi ± 2,2, ao contrário dos animais infectados com a cepa FGA/89, BR-01/MR (controle) e mock. Adicionalmente, a cepa FGA/NA a5c apresentou maior replicação viral e produção de partículas virais infectivas no SNC murino no 9° dpi, quando comparado à cepa parental (3,7 e 19,2 vezes, respectivamente,). No entanto, in vitro, não foi possível detectar diferenças na replicação viral e produção de partículas virais infectantes em culturas primárias de neurônios e macrófagos peritoniais de camundongos infectados com as cepas FGA/89, FGA/NA a5c e BR-01/MR. Visando conhecer a resposta do hospedeiro a infecção, camundongos suíços foram infectados com 8.000 ffuC636 das cepas, FGA/89 e FGA/NA a5c, e o perfil de modulação da expressão gênica nos dias 5, 6, 7 e 8 dpi, foram analisados utilizando o VCU Mus musculus biochip (Virginia Commonwealth University, USA). As análises de bioinformática revelaram a modulação na expressão de 148 genes no SNC murino infectado com ambas as cepas, FGA/89 e FGA/NA a5c com relação ao mock. Analises com o software Ingenuity Pathways Systems (IPA) demonstraram que as principais vias moduladas no SNC murino infectado são: via de sinalização por IFN, processamento e apresentação de antígenos, ativação do complemento e via tipoubiqutinação. Adicionalmente, análises in silico permitiram selecionar 15 genes como modulados diferencialmente na infecção com a cepa neuroadapatda FGA/NA a5c, comparada a parental FGA/89. Dentre estes, chama a atenção a expressão diferencial de 4 genes que codificam para quimiocinas quimioatrativas. Além disso, a quantificação da modulação da expressão gênica por qPCR corroborou os dados de microarranjo. Atualmente, esta sendo realizada a caracterização biológica das vias em questão, objetivando definir a sua importância na patogenia da encefalite por DENV-1 em modelo murino.

Dengue virus (DENV) causes a self-limiting fever (DF) or severe hemorrhagic fever/shock-syndrome (DHF/DSS). Recently, clinical profile of DENV infection is changing, and neurological manifestations are becoming frequent. Aiming determine the viral factors responsible for neurovirulent phenotype in mice, we perform biological and molecular characterization of FGA/89 (parental) and FGA/NA a5c (neurovirulent). We demonstrated that mutations on E (Met196/Val and Thr276/Pro) and NS3 (Leu435/Ser) proteins may account for DENV neurovirulence for mice. Additionally, animals infected with FGA/NA a5c show higher viral replication and production of viable viral particles at 9 days post-infection (dpi) than animals infected with FGA/89 (3.7 and 19.2 x, respectively). Animals infected with FGA/NA a5c show clinical signs of encephalitis around 10 dpi and succumb to death (13.1 dpi ± 2.2), in contrast with animals infected with FGA/89, BR-01/MR (control) and mock. However, we are not able to detect differences in viral replication and production of viable viral particles in primary cultures of neuron and peritoneal macrophages, infected with FGA/89, FGA/NA a5c and BR-01/MR. Aiming to determine host response to infection with neurovirulent (FGA/NA a5c) and parental (FGA/89) strains of DENV-1, we use VCU Mus musculus biochip (Virginia Commonwealth University, USA) encompassing whole mouse genome. Newborn Swiss mice were infected intracerebraly with 8.000ffuC636 of FGA/89, FGA/NA a5c and mock. Microarray analyzes were carried out at 5, 6, 7 and 8 dpi in central nervous system (CNS) of mock, FGA/89 and FGA/NA a5c infected animals. Bioinformatic analysis reveals 148 genes up-regulated in CNS infection by DENV-1, at higher levels in animals infected with FGA/NA a5c. Analysis with software Ingenuity Pathways Systems (IPA) shows that the main pathways modulated by DENV infection in the mouse CNS are IFN signaling, antigen presentation, complement cascades and protein ubiquitination. Additionally, by in silico analyses, we selected 15 genes, among those 4 are of special interest and are genes of chemokines with chemoattractant activity, that are up-regulated by infection with neurovirulent virus against parental. Actually we are performing biological characterization of selected genes and pathways.