Preparação e caracterização de lipases imobilizadas para utilização em biocatálise

Abstract

Resumo: Este trabalho teve por objetivos utilizar suportes hidrofóbicos e hidrofílicos para imobilizar lipases de Burkholderia cepacia LTEB11. Além disso, visou empregar as lipases em reações de síntese de ésteres através de esterificação, interesterificação e transesterificação em meios aquo-restritos. Dentre 10 suportes disponíveis para a imobilização, Accurel EP 100 (polipropileno) foi selecionado para os estudos em biocatálise por apresentar a melhor eficiência de imobilização e boa retenção da atividade na hidrólise do pNPP (palmitato de p-nitrofenila) em n-heptano. Após a seleção do suporte, o procedimento de imobilização foi inovado através da "simultânea produção e imobilização de lipases" (SPIL). O processo SPIL foi estudado por delineamento fatorial 33 fracionário com três repetições no ponto central. As variáveis independentes estudadas foram: tempo (h) de adição do suporte, concentração de suporte (g.L-1) e concentração (%, v/v) de óleo de oliva no meio de cultura. A nova metodologia de imobilização, aliada aos estudos por delineamento fatorial, foi viável, pois possibilitou um aumento da atividade da enzima imobilizada de 1,0 U.mg-1 pela metodologia convencional para 2,6 U.mg-1. Nos estudos de biocatálise, comparou-se a produção do oleato de etila utilizando a enzima livre e imobilizada em dois sistemas reacionais: contendo n-heptano e o etanol como solvente. Para o primeiro, foi observado que o melhor resultado (95 % de conversão em éster, 1 h) foi obtido quando se utilizou a enzima imobilizada por SPIL. Para o segundo, foi obtido 77,5% e 77,4% de éster, respectivamente para as duas preparações imobilizadas pelo processo convencional e por SPIL e de apenas 38% para a enzima livre, após 48 h de reação. Para as reações de interesterificação foi estudado a tipos seletividade (em n-heptano) da lipase imobilizada. Nas reações entre a tricaprilina (TC8:0) e TAGs (triacilgliceróis) contendo resíduos acílicos saturados de 4 a 18 carbonos, os estudos mostraram que a eficiência catalítica aumentou com a diminuição da cadeia carbônica, sendo a porcentagem de interesterificação e a atividade específica maior para a tributirina (TC4:0) (2880 U.mg-1 e 86% respectivamente) e menor para a triestearina (TC18:0) (368 U.mg-1 e 40%). Nos estudos do efeito da insaturação da cadeia, feitas com 0 a 3 insaturações, a atividade específica da enzima diminuiu com o aumento do número de insaturações na cadeia: foi maior e praticamente igual para a triricinoleina [TC18:1 ?9 (OH)] (1144 U.mg-1 ) e trilinoleína (TC 18:2 ?9,12) (1056 U.mg-1) e menor para a trilinolenina (TC 18:3 ?9,12,15) (432 U.mg-1). Quando se avaliou a porcentagem de interesterificação em 24 h, o maior rendimento foi obtido com a (TC 18:2 ?9,12) (67%). Para as reações de transesterificação, utilizou-se o óleo de mamona para a produção de ésteres (etílicos e metílicos) sem co-solvente. A partir da reação de etanólise, estudou-se a influência da atividade de água do biocatalisador (aw), quantidade de enzima, razão molar, temperatura e adição do etanol em duas etapas. O melhor resultado, foi de 96% de produção de ésteres etílicos em 8 h de reação para um sistema sem controle da aw, com 150 mg de enzima (400 U), razão molar óleo:álcool 1:3, temperatura de 30 °C e adição do etanol em uma etapa. Os resultados obtidos neste trabalho mostram que a lipase de B. cepacia LTEB11, após a imobilização em Accurel, apresentou maior atividade catalítica. Além disso, sua alta estabilidade em solventes orgânicos e versatilidade para catalisar diferentes reações com transferência de grupos acila, torna-a interessante para aplicações em biocatálise.

Abstract: The aims of this work were, firstly, to study the immobilization of lipases of Burkholderiacepacia LTEB11on hydrophobic and hydrophilic supports and, secondly, to use theimmobilized lipases in esterification, interesterification and transesterification reactions inwater-restricted systems for the production of esters. Amongst tensupports, Accurel EP 100(polypropylene) gave the highest immobilization efficiency and the highest pNPPhydrolyzing activity in D-heptane. A novel immobilization method, denoted "SimultaneousProduction and Immobilization of Lipases" (SPIL), was developed. A33factorial experimentwith three repetitions of the central point was used to optimize this method. The independentvariables were the time of addition of the support, the concentration of support added and theconcentration of olive oil in the culture medium. These optimization studies enabled anincrease in the specific activity of the immobilized preparation from 1.0U.mg1,obtained forconventional post-cultivation immobilization on Accurel, to 2.6 U.mg'. In the studies ofbiocatalysis, the synthesis of ethyl oleate was compared using free enzyme, conventionallyimmobilized enzyme and enzyme immobilized by theSPILmethod. Two solvents, o-heptaneand ethanol, were used indifferent reactions. In the n-heptane system the best result (a 95%ester yield in1 h) was obtained using enzyme immobilized by theSPILmethod. Similar esteryields were only obtained after3 h with the conventionally immobilized enzyme andafter4 hwith the free enzyme. After 48h inthe ethanol system, both the conventionally immobilizedenzyme and that immobilized by the SPIL method gavea 77% yield, while the free enzymegavea yield of only 38%. In interesterification reactions the typoselectivity for fatty acidchain size was studied using tricaprylin (TC8:0) and triacylglycerols containing saturated acylgroups from4 to18carbons. The catalytic efficiency increased with decrease in length of theacyl chain, with the percentage of interesterification and the specific activity being greatestfor tributyrin (TC4:0) (86% and2880U.mg1,respectively) and lowest for tristearin (TC 18:0)(40% and 368 U.mg1). The specificity of the immobilized enzyme forunsaturations wasstudied using tricaprylin and triacylglycerols C18 with0 to3 unsaturations. The specificactivity decreased with increase in the number of unsaturations: high values were obtained fortriricinolein (TC 18:1 A9(OH), 1144 U.mg1) and trilinolein (TC 18:2A9’12, 1056 U.mg1),whilea low value was obtained for trilinolenin (TC 18:3 A9’12’1, 432 U.mg1). The highestpercentage interesterification at 24 h was obtained with trilinolein (67%). For thetransesterification reactions, ethanolysis of castor bean oil was studied, without any co-solvent. The effects of the water activity, the amountofenzyme, the oil to alcohol molarratioand the temperature were studied, as well as the addition of ethanol in two stages. The bestresult, with a 96% ethyl ester yield in8 h, was obtained with a reaction system withoutcontrol of water activity, with 150 mg of enzyme (400 U),a 1:3 oil to alcohol molar ratio,atemperature of 30 °C and with a single addition of ethanol. This work has demonstrated thatthe lipase of B. cepacia LTEB11 shows a greater catalytic activity after immobilization inAccurel. Further, the versatility of this enzyme in catalyzing different acyl transfer reactionsmakes it interesting for applications in biocatalysis.