Imunocitoquímica e imunohistoquímica para o diagnóstico laboratorial da Leishmaniose Tegumentar Americana

Abstract

Resumo: O aumento significativo no número de casos notificados da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e a expansão geográfica da endemia têm motivado o desenvolvimento de novas tecnologias para auxiliar no diagnóstico das leishmanioses, visando minimizar as restrições apresentadas pelos testes diagnósticos disponíveis nos serviços de saúde. O presente trabalho empregou imunocitoquímica e imunohistoquímica (ICQ/IHQ) como métodos diagnósticos laboratoriais para LTA. Amostras de culturas de Leishmania in vitro e cortes histológicos de lesões em animais infectados experimentalmente foram submetidos à ICQ/IHQ, utilizando anticorpos policlonais desenvolvidos para este estudo e o complexo avidina-biotina modificado (Ultra Streptavidin). Foram avaliados o processo de fixação das amostras além da especificidade, estabilidade e imunorreatividade dos anticorpos policlonais. Lâminas de vidro comum, secagem ao ar por 10 minutos e fixação em etanol (95%) apresentaram resultados adequados para ICQ. Em preparações contendo microrganismos comumente encontrados nas lesões de portadores de LTA, a especificidade da metodologia foi de 100%. Os anticorpos policlonais congelados (-20°C) mantiveram-se estáveis por 10 meses. Os anticorpos policlonais purificados por cromatografia (Sephadex@)e obtidos a partir de antígenos insolúveis de L. (V.) braziliensise L. (L.) amazonensis apresentaram maior imunorreativídade e melhores resultados nas preparações ICQ/IHQ. Em comparação com outras técnicas empregadas parao diagnóstico da LTA, nos casos avaliados, a IHQ apresentou resultados semelhantes aos da histopatologia com coloração HE, com sensibilidade de 33,3% para formas amastigotas. Quando considefadaa presença de antígenos de Leishmania no padrão celular, a IHQ apresentou uma sensibilidade de 83,3%, sendo significativamente maior que na relativa à histopatologia e compatível com métodos padrão ouro de culturae PCR. As metodologias de ICQ/IHQ desenvolvidas neste trabalho foram capazes de demonstrar em amostras de culturas in vivo e in vitro e em biópsias de lesões, a presença de formas promastigotas, amastigotas e antigenos de Leishmania, ofefecendo contribuição adicional ao diagnóstico da LTA, sendo de fácil aplicação e podendo ser utilizada no sistema público de saúde.

Abstract: The significant increase in American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) notified cases and thegeographic expansion of this endemyhas motivated the development of new techniques to help in leishmaniasis diagnosis, seeking the minimization of the restrictions imposed by the diagnostic tests available at the health services. The current study applied immunocytochemistry and immunohystochemistry methods (ICC/JHC) for laboratory diagnosis of ATL. Invitro culture and histological sections from tissue experimentally infected were submitted to ICC/IHC using polyclonal antibodies developed for this study and a modified avidin-biotin complex (Ultra Streptavidin ). The specimens fixing protocol and the polyclonal antibodies specificity, estability and immunostaining were evaluated. Ordinary slides, air drying for 10 minutes and ethanol (95%) fixing achieved good ICC staining. The specificity was 100 % in specimens infected with organisms frequently found in ATL lesions. Frozen at -20oC antibodies immunoreactivity was stable for 10 months. The polyclonal antibodies purified by chromatography (Sephadex ) and obtained from L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis insoluble antigens presented most immunostaining and best results in ICC/IHQ. Compared with other useful techniques forthe ATL diagnosis, at the cases evaluated, IHC showed thesame results as hematoxylin and eosin stained (33,3%) for amastigotes recognition. When the presence of Leishmania antigens was evaluated at the cellular pattern, IHC presented 83,3% sensitivity, higher than histopathology and consistent with gold standard methods (culture and PCR). The ICC/IHC techniques developed in the current study were able to recognize promastigotes and amastigotes forms and also Leishmania antigens in sample culture (in vivo and in vitro) and in lesion biopsies, offering an additional help to ATL diagnosis once it can be easily applied at the health public system.