Neuroadaptaçao de virus dengue em modelo murino : identificaçao de marcadores moleculares

Abstract

O vírus da dengue (DENV), um membro do gênero Flavivirus (família Flaviviridae), é um arbovírus que causa severa doença em humanos. O espectro da doença varia desde uma febre indiferenciada (FD) até a febre hemorrágica da dengue (FHD), que pode evoluir para a síndrome do choque da dengue (SCD) e morte. Mais recentemente, o perfil clínico da infecção pelo DENV está mudando e um aumento significativo de casos clínicos com manifestações neurológicas vem sendo documentado. O(s) mecanismo(s) pelo qual o DENV pode causar doença grave e a contribuição de fatores virais e do hospedeiro para o desenvolvimento dos quadros clínicos severos, não está completamente compreendido. A falta de um modelo animal, que reflita as formas graves da doença é um obstáculo para se estudar alguns aspectos da patogênese da dengue. O sistema nervoso central (SNC) de camundongos neonatos tem sido utilizado como modelo para compreender a fisiopatologia da doença. Para confirmar e definir o envolvimento de substituições de aminoácidos no genoma viral que pudessem estar relacionadas com a aquisição de um fenótipo de neurovirulência do DENV em camundongos, a cepas do sorotipo 1 do vírus (DENV-1) FGA/89 foi adapta ao SNC de camundongos neonatos suíços. A capacidade da nova variante neuroadaptada replicar-se no SNC e provocar encefalite foi analisada. Durante o processo de neuroadaptação do vírus FGA/89, uma substituição de aminoácido na proteína de envelope (E) e duas na proteína não-estrutural 3 (NS3) foram observadas. Estas mutações foram identificadas primeiramente nos vírus resultantes da terceira passagem (FGA/NA P3) e observadas até a sexta passagem. As substituições E Phe402/Leu e NS3 Leu480/Ser identificadas na variante FGA/NA P3-P6, embora não idênticas àquelas observadas em FGA/NA d1d (outra variante neuroadaptada a partir da mesma cepa parental, FGA/89), mapeiam nos mesmos domínios, sugerindo um papel potencial dessas proteínas na aquisição do fenótipo de neurovirulência do DENV-1 em camundongos. Com o intuito de confirmar o envolvimento dessas mutações, um isolado clínico recente (BR/01-MR) foi submetido ao mesmo processo de neuroadaptação. Embora a variante MR/NA P7 tenha se mostrado mais neurovirulenta do que a variante FGA/NA P6, ocasionando danos severos no SNC de camundongos, caracterizados por leptomeningite e necrose de substância branca, não foi possível identificar a presença de partículas infecciosas nem do RNA viral em cada uma das passagens do vírus. No entanto, através de ensaios microscopia eletrônica e imunocitoquímica de secções do SNC de camundongos foi possível observar tanto a presença de partículas virais como das proteínas E e NS1, sugerindo que os danos no SNC dos camundongos infectados foi uma conseqüência direta da infecção pelo vírus. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram demonstrar a implicação das proteínas E e NS3 no processo de neurovirulência do vírus FGA/NA 89 e que as variantes neuroadaptadas apresentam a capacidade de infectar as células do SNC de camundongos neonatos e ocasionar danos extensivos nos tecidos como leptomeningite e encefalite. Um maior conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na patogênese da dengue poderá contribuir para o delineamento de estratégias antivirais direcionadas e eventualmente o controle da infecção.

Dengue virus (DENV), a member of the Flavivirus genus (family Flaviviridae), is an arthropod-borne virus that cause severe disease in humans. The spectrum of illness ranges from a self-limiting fever (DF) to dengue hemorrhagic fever (DHF), which can progress to dengue shock syndrome and death. More recently, the clinical presentation of DENV infection is changing and a significant increase of cases with neurological manifestations has been documented. The precise mechanim(s) by which DEN viruses cause severe disease is still not understood. It has been inferred that both immunological and viral factors determine the severity of disease. The lack of an animal model that reflects the severe forms of the disease is an obstacle to study some aspects of dengue pathogenesis. The central nervous system (CNS) of newborn mice has been used as a model system to study the pathophysiology of dengue disease. To confirm and to define the involvement of the amino acid substitutions in the viral genome that could be related to the acquisition of DENV neurovirulent phenotype for mice, we adapted a strains of dengue virus type 1, FGA/89, in CNS of newborn Swiss mice. The capacity of the neuroadapted variants to replicate in CNS and to cause encephalitis was analyzed. One amino acid mutation in the envelope E protein and two amino acid mutations in the nonstructural NS3 protein were observed during the neuroadaptation process of FGA/89. These mutations were first identified in FGA/NA P3 and fixed until the sixth passage. The substitutions E Phe402/Leu and NS3 Leu480/Ser identified in FGA/NA P3-P6, although not identical to those observed in FGA/NA d1d (another neuroadapted variant from the same parental strain, FGA/89), mapped to the same domain, suggesting a potential role of these proteins in the acquisition of DENV mice neurovirulent phenotype. Aiming to confirm the involvement of these mutations in dengue neurovirulence, a recent clinical isolate (BR/01-MR) was submitted to the same protocol of neuroadaptation. The neurovirulent variant MR/NA P7 was more neurovirulent for newborn Swiss mice, compared to FGA/NA P6 variant, causing severe damage in CNS of mice, characterized by leptomeningitis and necrosis of white matter. Despite of all these findings, it was not possible to identify neither the presence of viral infectious particle nor the presence of the viral RNA in all the passages of the virus in mice brains. However, by electron microscopy and immune electron microscopy assays it was possible to observe the presence of viral particles and viral proteins E and NS1 in the sections of the CNS of mice, suggesting that the damage observed in the CNS was a direct result of virus infection. Results obtained in this work demonstrate the implication of the proteins E and NS3 in the process of neuroadaption of the virus FGA/89 and that the neurovirulent variants have the ability to infect CNS of newborn mice causing extensive tissue damage as leptomeningitis and encephalitis. A better knowledge about molecular markers and mechanisms that could be involved in the dengue pathogenesis would be useful for developing new targets to antiviral strategies and eventually control of infection.