Estudo da interação in vitro da Rho GTPase de baixa massa molecular Rnd1 e a proteína STI1 (stress-inducible protein 1)

Abstract

O objetivo deste trabalho foi investigar a possível interação in vitro entre as proteínas Rnd1, uma GTPase de baixa massa molecular pertencente à família de proteínas Rho, e STI1 (stress-inducible protein 1), um ligante para a proteína prion celular. Para tanto, foi necessário produzir reagentes específicos que pudessem permitir o estudo e a compreensão desta possível interação. A pequena GTPase Rnd1 e a proteína STI1 são ambas expressas no sistema nervoso central e estão envolvidas em crescimento de neuritos e na plasticidade do citoesqueleto sugerindo uma possível participação da interação Rnd1-STI1 nestes eventos celulares. Células da linhagem SH-SY5Y e cultura primária de neurônios do hipocampo de camundongos E16 foram utilizadas em ensaios de imunofluorescência com os anticorpos anti-STI1 e anti-Rnd1 para avaliar a distribuição e a co-localização destas proteínas nestes tipos celulares. Nossos resultados demonstram que tanto a quimera protéica GFP-STI1, expressa em células 293T transfectadas quanto a proteína endógena presente em extratos de encéfalos de camundongos interagem com a proteína GST-Rnd1 imobilizada na matriz de glutationa-sepharose. GFP-STI1 e STI1 endógena interagem especificamente com a proteína GST-Rnd1 já que pouca STI1 ou GFP-STI1 interage com GST. As imunofluorescências e o ensaio de co-imunoprecipitação corroboram os resultados obtidos nos ensaios de pull-down. Assim, especula-se que STI1 e Rnd1 poderiam interagir in vivo, possuindo tal interação relevância nos processos de plasticidade do citoesqueleto, ação neuroprotetora e neuritogenese. A relevância biológica para está possível interação está sob investigação.

The aim of this work was to investigate an in vitro interaction between Rnd1, a small GTPase, and STI1, a cellular prion ligand. Both are expressed in central nervous system and are involved with neurite outgrowth and cytoskeleton plasticity, suggesting a putative cross-talking. Based on these data and other reported results, we decided to investigate if a specific interaction between Rnd1 and STI1 could be observed. Recombinant Rnd1 protein was obtained by an E. coli heterologous system after bacterial cells transformation by pGEX4T2-Rnd1 and pQE30-Rnd1 vectors. SH-SY5Y cell line and primary cultures from mouse hipocampal E16 brain were used for imunofluorescence assays with anti-STI1 and anti-Rnd1to verify a putative colocalization. Our results show that both GFP-STI1 fusion proteins, expressed in 293T cells, and endogenous STI1 from mouse brain interact with GST-Rnd1 immobilized on glutathione-sepharose beads. While GFPSTI1 and endogenous STI1 specifically bind GST-Rnd1, little binding was observed when GST alone was immobilized on sepharose beads. Rnd1 and STI1 can in vitro interact and its biological relevance may involve cytoskeleton plasticity and neurite outgrowth during SNC development and maintenance. The immunofluorescence and the co-immunoprecipitation assays support possible physical and functional interaction between Rnd1 and STI1. Biological relevance for this association is under investigation.