Colletotrichum acutatum : melanização, penetração em membranas artificiais, autofagia e mobilização de lipídeos

Abstract

A antracnose causada por espécies de Colletotrichum afeta uma variedade de importantes plantações pelo mundo. Fungos fitopatogênicos desse gênero apresentam apressórios melanizados, vacúolos e corpos lipídicos no citoplasma. A melanização do apressório e a digestão dos triacilgliceróis dos lipídeos armazenados têm sido descritas como vitais para a germinação e penetração do hospedeiro. No presente trabalho, foi utilizado um inibidor de síntese de melanina (a carpropamida) para estudar a germinação e penetração de Colletotrichum acutatum em membranas de celofane. Este composto foi eficiente e produziu apressórios hialinos. Ao contrário do esperado, a ausência de melanização não impediu a penetração do apressório, diferindo do que tem sido demonstrado para outros fungos fitopatogênicos, nos quais a melanina é crucial para a penetração do apressório. As análises ultraestruturais demonstraram espessa camada contínua e eletrodensa, provavelmente de melanina, nas paredes celulares dos apressórios das células controle, que não foi encontrada nos apressórios hialinos. Os apressórios das células do controle e do tratamento apresentaram grânulos eletrodensos no citoplasma e na parede celular, em possível processo secretório de natureza ainda desconhecida. Da mesma forma, em ambos os casos foi observada abundante matriz extracelular ao redor dos apressórios através de DIC (contraste de interferência diferencial) e microscopia eletrônica de varredura. Através de análise de imagem foi medido o conteúdo de lipídeos nos conídios germinados e estruturas de infecção de apressórios hialinos controle e tratados. Estes resultados sugerem, dentre outras possibilidades, que os conídios possam metabolizar e aproveitar os esqueletos de carbono do composto adicionado. Em todas as situações de germinação estudadas observou-se a formação de conídios secundários. Análises destas células coradas com vermelho Nilo e laranja de acridina e observadas em microscopia confocal revelaram que o armazenamento de corpos lipídicos e a reorganização de pequenos vacúolos dentro do conídio secundário acontecem simultaneamente à vacuolização e diminuição de corpos lipídicos no conídio germinado. Depois de formado, o conídio secundário apresentou aspecto morfológico semelhante ao conídio não germinado a partir do qual se originou. Lipídeos e vacúolos também foram investigados durante o envelhecimento dos conídios através de microscopia confocal e eletrônica de transmissão. Os resultados demonstraram que os corpos lipídicos desaparecem do citoplasma concomitantemente com a vacuolização durante o envelhecimento. Estes vacúolos realizaram autofagia, demonstrada usando um inibidor de protease vacuolar. A autofagia de corpos lipídicos e outras estruturas celulares também foi verificada em conídios germinados e apressórios. O conjunto de resultados reforça a idéia de que o conhecimento dos mecanismos envolvidos na produção de esporos, germinação e infecção do hospedeiro pode ajudar na elaboração de estratégias de controle desse fungo.

Anthracnose caused by Colletotrichum spp. affects a variety of economically important crops around the world. Phytopathogenic fungi of this genus show melanized appressoria, vacuoles and lipid bodies in the cytoplasm. Appressoria melanization and triacylglycerol digestion of the lipid bodies have been reported as crucial for germination and penetration of the host. In the present work, it was used an inhibitor of melanin biosynthesis (carpropamid) to study germination and penetration by Colletotrichum acutatum on cellophane membranes. This substance led to the development of hyaline appressoria. Contrary to the expected, the lack of melanization did not prevent appressoria from penetrating cellophane membranes, differing from what has been demonstrated for other phytopathogenic fungi, in which melanin is crucial to appressorial penetration. Ultrastructural analysis demonstrated a thick and electron dense layer, probably melanin, in appressoria cell walls of control cells, which was not found in hyaline appressoria. Appressoria of control and carpropamid treated cells showed electron dense granules in the cytoplasm and in the cell wall, in a possible secretory process of a still unknown nature. Likewise, in both cases a large amount of extracellular matrix was observed around appressoria using differential interference contrast (DIC) and scanning electron microscopy. The lipid content in germinated conidia and infection structures from hyaline appressorium was measured in control and treated cells with image analysis. The results suggest, among other possibilities, that conidia can use the compound added (carpropamid) as a carbon source. In all situations of germination studied here, secondary conidia formation was observed. Analysis by confocal microscopy of cells stained with Nile red and acridine orange revealed that the storage of lipid bodies and reorganization of small vacuoles inside the secondary conidium happen simultaneously with the vacuolization and decrease in lipid bodies in the germinated conidium. After being formed the secondary conidium displayed a morphological aspect similar to the nongerminated conidium from which it was originated. Lipids and vacuoles were also investigated during conidia aging using confocal microscopy and transmission electron microscopy. The results demonstrated that lipid bodies disappeared from the cytoplasm concurrently with vacuolization during aging. Autophagy in these vacuoles was demonstrated using a vacuolar protease inhibitor. Autophagy of lipid bodies and other cellular structures was also verified in germinated conidia and apressoria. All these results reinforce the idea that the unraveling of the mechanisms involved in spores production, germination and infection of the host may help in the construction of control strategies of this fungus.