Avaliação da citotoxicidade de uma mistura complexa de pesticidas, MeHg e DDT em hepatócitos de Hoplias malabaricus

Abstract

Resumo: Um procedimento de fácil reprodução para o isolamento de hepatócitos de Hoplias malabaricus e condições de cultivo foram padronizadas no capítulo I para posterior emprego em ensaios com xenobióticos (capítulos II e III). Os hepatócitos puderam ser cultivados durante 1-3 semanas, sendo que o período de uma semana foi escolhido como tempo limite para os ensaios. No capitulo II, avaliou-se o efeito de uma mistura de pesticidas organoclorados extraídos da gordura hepática de enguias expostas naturalmente e coletadas na Reseva de Camarguè – França, depois de 48 horas de exposição. O desenho experimental incluía dois controles (grupo controle e solvente) e duas concentrações da mistura (10 e 50 ng.ml-¹), sendo que foram analisados sete biomarcadores (atividade das enzimas catalase e glutationa S-transferase, concentração de glutationa reduzida, peroxidação de lipídios, incidência de apoptose, viabilidade celular e quebras do DNA), os quais responderam conforme o grupo experimental. No capítulo III, foi investigado o efeito do DDT e do monometilmercúrio (MeHg) após 96 horas de exposição. O desenho experimental incluía um grupo controle e quatro expostos (DDT a 50 nM, MeHg a 0,25 µM e a 2,5 µM, e uma mistura de DDT a 50 nM mais MeHg a 0,25 µM). Aos biomarcadores avaliados no capitulo II (com exceção do ensaio de quebras do DNA), acrescentaram-se oito novos para o capítulo III (atividade das enzimas superóxido dismutase, glutationa dissulfeto redutase, delta-aminolevulinato desidratase e glucose-6-fosfato desidrogenase, carbonilação de proteínas, concentração de glicogênio celular, produção de peróxido de hidrogênio e de ânion superóxido). Esses marcadores também responderam conforme o grupo experimental. A soma dos capítulos II e III configura-se no primeiro registro empírico de ensaios in vitro empregando hepatócitos da espécie Hoplias malabaricus como modelo para avaliar o efeito de xenobióticos.

A simple and easily reproducible procedure to isolate Hoplias malabaricus hepatocytes and the required culture conditions to maintain these cells were standardized in the chapter I. Then, two independent studies were conducted to evaluate the effects of xenobiotics (chapter II and III) on those cells. Hepatocytes were successfully cultured during 1-3 weeks, and the period of one week was selected as the limit of time for any assay. In the chapter II, the effects of one chlorinated pesticides mixture extracted from the eel hepatic lipids were determined after two days of cell exposure. The experimental design included two controls (control and solvent groups) and two different concentrations of the mixture (10 and 50 ng.ml-¹). Seven biomarkers were analyzed (enzymatic activities of catalase and glutathione S-transferase, concentration of reduced glutathione, lipid peroxidation, incidence of apoptosis, cell viability and DNA fragmentation). They responded according to each experimental group. In the chapter III, the effects of concentrations of DDT and monomethyl mercury (MeHg) reported in the tissues of fishes naturally raised were investigated after four days of cell exposure. The experimental design included one control and four tested groups (DDT at 50 nM, MeHg at 0,25 µM and at 2.5 µM, and the mixture of DDT at 50 nM plus MeHg at 0,25 µM). To the aforementioned biomarkers analyzed in chapter II, eight new biomarkers were added (activity of superoxide dismutase, glutathione reductase, deltaaminolevulinic acid dehydratase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, protein carbonyl content, glycogen content and production of hydrogen peroxide and superoxide anion), which varied according to each experimental group. The sum of chapters II and III is the first empirical register of in vitro assays using Hoplias malabaricus hepatocytes as a research model to evaluate the effects of xenobiotics.