Produção de fragmentos de anticorpo recombinante para detecção do fator de crescimento epiregulina

Abstract

Resumo: Os anticorpos monoclonais possuem uma alta seletividade pelo seu alvo. Esta propriedade lhes confere com grande potencial biotecnológico e terapêutico, sendo atualmente a principal classe de biofármacos existente. A estrutura tridimensional dos anticorpos é composta por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas unidas entre si por pontes dissulfeto. Cada cadeia possui uma região constante e uma região variável formando o sítio de reconhecimento e ligação ao antígeno. Existem cinco classes de anticorpos em mamíferos: IgA, IgM, IgE, IgD e IgG, sendo a última a mais abundante entre elas. Através do desenvolvimento de novas técnicas e o advento da tecnologia do DNA recombinante, foi possível manipular a sequência das proteínas. A engenharia de anticorpos surgiu para atender as demandas da pesquisa e de tratamentos clínicos e novos formatos de imunoglobulinas foram sendo desenvolvidos. Dentre eles os fragmentos de anticorpos, como o scFv e o Fab, são muito populares devido a sua menor complexidade e tamanho em comparação a imunoglobulina intacta. Além disso, podem ser produzidos em sistemas mais baratos como a bactéria Escherichia coli, despertando ainda mais o interesse por essas moléculas. O Fab 9E5 anti-epiregulina humana (EPR) é um fragmento derivado de um anticorpo monoclonal murino e foi o objeto de estudo deste trabalho devido a relevância que a EPR possui no desenvolvimento de diferentes neoplasias. O objetivo deste trabalho então foi produzir fragmentos de anticorpo do tipo scFv e Fab anti-EPR Escherichia coli, a fim de testar e comparar suas afinidades e seletividade pela EPR. Para a construção do scFv foram realizadas amplificações dos genes da cadeia leve e pesada utilizando como molde o fragmento de anticorpo anti-EPR do tipo Fab. Testes de expressão foram realizados para determinar as melhores condições de expressão dos anticorpos. A condição escolhida para prosseguir com os testes de purificação foi 16°C -1 6 horas. Também foram expressas e purificadas as construções em pET32a, em fusão com a tioredoxina, dos fatores da família EGF: EPR, EPGN, ARG e HB-EGF. Além disso, foi desenvolvido o vetor pETGOF para identificação direta de clones contendo genes de interesse, através da utilização de uma fusão com a proteína repórter SGFP2 e também para a evolução molecular das sequências dos anticorpos. Foi realizada a clonagem da SGFP2 fora da pauta de leitura com o vetor pET28a-TEV. Com isso, a SGFP2 será fluorescente somente quando houver a clonagem correta de insertos, o que restabelece a pauta de leitura do vetor. Com relação a tentativa de construir um sistema genético que utiliza a T7 RNA polimerase para possibilitara expressão de proteínas ca cepa de E. co liTOP10, o gene da enzima foi clonado no vetor para expressão em E. coli pTrc-His TOPO-NUP1 e testes de validação do sistema foram realizados. Os resultados obtidos sugerem que a expressão do gene da T7 é tóxico para as células TOP10. Por isso, passamos a usar a cepa BL21-Star (DE3) em combinação com o vetor pETGOF.

Abstract: Monoclonal antibodies have a high selectivity for their target. Hence, they are biomolecules with great biotechnological therapeutic potential, currently being the main class of existing biopharmaceuticals. The three-dimensional structure of antibodies is composed of two light chains and two heavy chains joined by disulfide bonds. Each chain has a constant region and a variable region, which forms the antigen recognition site. There are five classes of antibodies in mammals: IgA, IgM, IgE, IgD and IgG, the latter being the most abundant among them. Through the development of new techniques and the advent of recombinant DNA technology, it was possible to manipulate the sequence of proteins, paving the way to generate humanized antibodies and antibody fragments. Antibody engineering emerged to meet the demands of research and clinical treatments and new formats of immunoglobulins were being developed. Among them, antibody fragments, such as scFv and Fab, are very popular due to their less complex structure and size compared to intact immunoglobulins. In addition, they can be produced in cost-effective systems such as Escherichia coli. The Fab 9E5 recognizing human epiregulin (EPR) is a fragment derived from a murine monoclonal antibody and was the object of study in this work due to the relevance that EPR has in the development of several neoplasia. The aim of this work was, therefore, to produce antibody fragments of the scFv and Fab types in E. coli, in order to compare their affinity and selectivity for EPR. First, for the construction of the scFv, the light and heavy chain genes were amplified using the anti- EPR antibody fragment of the Fab type as a template for the PCR reactions. The heavy and light chains of the Fab were also subcloned into E. coli expression vectors. Expression assays were performed to determine the best expression conditions for the antibody fragments. The condition chosen to proceed with the purification tests was 16 °C for 16 hours. The Fab fragment was obtained at a satisfactory purification grade. Constructions of the EGF family factors in pET32a in fusion with thioredoxin, were also expressed and purified: EPR, EPGN, ARG and HB-EGF. In addition, the pETGOF vector was developed for direct identification of clones containing genes of interest, by using a fusion with the SGFP2 reporter protein and also for the molecular evolution of antibody sequences. SGFP2 was cloned frame shifted from the reading frame of the vector pET28a-TEV. Thus, SGFP2 will be fluorescent only when there is the correct cloning of inserts, which reestablishes the vector reading frame. Regarding the attempt to build a genetic system that uses the T7 RNA polymerase to enable the expression of E. coli TOP10 protein, the T7 RNA polymerase gene was cloned into the E. coli expression vector pTrc-His-TOPO-NUP1 and system validation tests were performed. The results obtained suggest that T7 gene expression is toxic to TOP10 cells. Therefore, we turned to the strain BL21-Star DE3 to be used in combination with vector pETGOF.