Análise de associação dos genes CYP1A1,GSTM1,GSTT1,GSTT1 e da perda de heterozigose em 3p em portadores de carcinomas bucais

Abstract

Resumo: Os cânceres de cabeça e pescoço, incluindo os da cavidade bucal, apresentam uma alta incidência no Brasil e a sobrevida média de aproximadamente cinco anos permanece como uma das menores entre os principais tipos de tumores malignos. Existe uma correlação entre enzimas envolvidas no metabolismo de xenobióticos, o uso do tabaco e a suscetibilidade genética a este tumor. Alterações genéticas no braço curto do cromossomo 3 (3p), sugerem que esta região possa conter genes supressores tumorais, como os já mapeados RARB, FHIT e VHL, envolvidos na etiologia desta neoplasia. No presente estudo foram avaliados genes candidatos de suscetibilidade ao câncer (CYP1A1, GSTM1 e GSTT1) em 91 pacientes portadores de carcinomas epidermóides bucais e em 81 controles sem história de neoplasias, pareados por idade, sexo, etnia e hábito tabagista. O envolvimento da região 3p foi investigado quanto à perda de heterozigose (LOH) pela análise de sete marcadores microssatélites em 75 dos pacientes da amostra. PCR-RFLP e PCR-Multiplex foram utilizadas na detecção das variantes dos genes do metabolismo. Nas análises de LOH, foram utilizados DNAs sangüíneos e tumorais e as reações de PCR foram realizadas utilizando-se iniciadores marcados com agentes fluorescentes (D3S1286, D3S1263, D3S1274, D3S1581, D3S1300, D3S1079 e D3S1307). A análise da variância e o teste do Qui-Quadrado foram utilizados, respectivamente, na comparação entre as médias dos tamanhos tumorais e na análise de parâmetros histopatológicos (tamanho do tumor, invasão de linfonodos regionais e grau de diferenciação tumoral) e clínico (óbito), para os dez marcadores moleculares. O estudo de associação caso-controle indicou ausência de associação positiva ou negativa: CYP1A1 (OR=1,24 – IC95%=0,67-2,31); GSTM1 (OR=0,61 – IC95%=0,33-1,11) e GSTT1 (OR=1,24 – IC95%=0,65-2,38). A análise combinada dos genótipos também mostrou ausência de associação: (OR=0,94 – IC95%=0,42-2,10) para indivíduos com dois genótipos considerados de risco e (OR=0,88 – IC95%=0,25-3,17) para indivíduos com três genótipos considerados de risco. Na análise dos parâmetros histopatológicos e clínicos, não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas. Em relação aos marcadores microssatélites, em todos os locos analisados foram encontradas freqüências de LOH elevadas, variando de 37,1% para o marcador D3S1263 a 55,2% para o marcador D3S1286. Dos sete marcadores analisados, seis (D3S1286, D3S1079, D3S1300, D3S1274, D3S1307 e D3S1581) mostraram freqüências de LOH próximas ou superiores a 50%. A análise da freqüência de LOH em locos combinados também mostrou uma alta taxa de perda alélica, variando de 79,1% (em pelo menos um dos locos) a 23,6% (em quatro ou dos mais locos). O parâmetro invasão de linfonodos regionais apresentou um resultado significativo para dois dos sete marcadores analisados: D3S1263 (x² 1=8,94; P<0,01) e D3S1307 (x² 1=5,64; P<0,05). Com base nestes resultados, concluímos que, nesta amostra, as variantes alélicas dos genes candidatos de suscetibilidade CYP1A1, GSTM1 e GSTT1 não influenciaram o desenvolvimento dos tumores bucais, porém, as altas taxas de LOH ressaltam a importância da região cromossômica 3p e dos genes RASSF1, RARB, FHIT e VHL no desenvolvimento deste tipo de neoplasia.

The head and neck tumors, including oral cavity, present a high incidence in Brazil and the median survival of up five years continues one of the lowest among the common types of cancers. Many studies have been demonstrating the importance of the correlation between xenobiotic metabolizing enzymes, the use of tobacco and the susceptibility to oral cancer. Genetic alterations in the short arm of chromosome 3 (3p), suggest that this region may contain tumor suppressor genes, as the already mapped RARB, FHIT and the VHL, involved in the etiology of this neoplasia. In the present study, putative cancer susceptibility genes (CYP1A1, GSTM1 and GSTT1) were evaluated in 91 patients with oral squamous cell carcinomas and in 81 healthy controls, matched by age, gender, ethnic group and smoking habit. Loss of heterozygosity (LOH) at 3p region was investigated using microsatellite markers analysis in 75 patients. PCR-RFLP and PCR-Multiplex were used to detect genes variants. Peripheral blood DNA as control and tumor DNA were used to perform LOH analysis and the PCR reactions were performed with labeled primers with fluorescents agents (D3S1286, D3S1263, D3S1274, D3S1581, D3S1300, D3S1079, D3S1307). The variance analysis and the Chi-square test were used respectively, to compare the tumour size mean and in the analysis of the histopathological (tumor size, lymph node invasion and tumor differentiation) and clinical (death) parameters, for the ten molecular markers. The casecontrol association study did not detect positive or negative association: CYP1A1 (OR=1,24 – IC95%=0,67-2,31); GSTM1 (OR=0,61 – IC95%=0,33-1,11) and GSTT1 (OR=1,24 – IC95%=0,65-2,38). The combining genotypes analysis also showed an absence of association: (OR=0,94 – IC95%=0,42-2,10) for individuals with two considered risk genotypes and (OR=0,88 – IC95%=0,25-3,17) for individuals with three considered risk genotypes. When the analysis of the histopathological and clinical parameters were performed no statistical significative differences were found. For microsatellites markers, in all loci analyzed we found a high frequency of LOH, varying of 37.1% for the marker D3S1263 to 55.2% for the marker D3S1286. Among the seven markers analyzed, six (D3S1286, D3S1079, D3S1300, D3S1274, D3S1307 and D3S1581) showed frequencies near or superior to 50%. The combining loci analysis also showed a high frequency of allelic loss, varying of 79.1% (in at least one locus) to 23.6% (in four or more locus). A significative result in two out of seven markers analyzed: D3S1263 (x² 1=8.94; P<0.01) and D3S1307 (x² 1=5.64; P<0.05) was seen in the analysis of lymph node invasion. Based in these results, we conclude that, in this sample, the allelic variants of the putative susceptibility genes CYP1A1, GSTM1 and GSTT1 did not have influence in the development of oral cancer, however, the high frequencies of LOH point to the importance of the genomic region 3p and the genes RASSF1, RARB, FHIT and VHL in the development of these neoplasia.