33287015001P7 Programa de Pós-Graduação em Multicêntrico em Bioquímica e Biologia Molecular

Avaliação genética de possíveis casos de deficiência de descarboxilases de aminoácidos aromáticos em pacientes com atraso do neurodesenvolvimento e transtornos motores

Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT

Avaliação genética de possíveis casos de deficiência de descarboxilases de aminoácidos aromáticos em pacientes com atraso do neurodesenvolvimento e transtornos motores Resumo: A paralisia cerebral (PC) é causada por lesões neuronais de origem gestacional, obstétrica ou perinatal. Estas lesões podem ser desencadeadas por hipóxia, hipoglicemia, traumatismo, hemorragia, infecções, exposição a substâncias químicas e alterações genéticas como a deficiência da descarboxilase de aminoácidos aromáticos (AADCD, do inglês Aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency). A AADCD é uma doença rara, com padrão autossômico recessivo e com mais de 580 variantes genéticas já descritas. As principais manifestações clínicas da AADCD são crises oculogíricas, hipotonia, alterações autonômicas, distúrbios do neurodesenvolvimento e transtornos motores (DNTM). O diagnóstico da AADCD, normalmente clínico, pode ser confirmado por exames bioquímicos e genéticos. Análises genéticas realizadas por sequenciamento de nova geração (NGS, do inglês Next Generation Sequencing) permitem identificar novas variantes gênicas. Em relação ao tratamento da AADCD, os fármacos disponíveis apresentam eficácia limitada aos casos leves. Entretanto, terapia gênica recentemente desenvolvida e aprovada no Brasil (eladocageno exuparvoveque) demonstram resultados promissores incluindo os quadros clínicos moderados e graves. Diante disso, esse estudo teve como objetivo determinar possíveis casos de DDC bem como caracterizar o perfil sociodemográfico e clínico de pacientes com PC/DNTM. A partir de células da mucosa bucal, foi realizado painel genético (121 genes), por meio de NGS, em 44 pacientes com DNTM atendidos por uma Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais localizada em município da região Oeste do Paraná, Brasil. Os resultados, descritos de forma quantitativa, foram analisados pelo teste do qui Quadrado (p<0,05*) para avaliar a associação entre as variáveis categóricas e suas respectivas frequências observadas e esperadas. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Paraná (parecer nº 6.568.371 e C.A.A.E. 74574323.1.0000.0102). Painel genético apresentou resultado ausente para DDC em todos os pacientes. Contudo, um participante apresentou alteração genética em heterozigose não relacionada a DDC e considerada de significado clínico incerto (gechr6:161.973.300-166.167.591, CNV-deleção de 4.2 Mb em 6q26q27). Amostra caracterizada por participantes predominantemente do sexo masculino (59,1%), com idade inferior a 18 anos (52,3%), renda familiar per capita de 1 salário mínimo (59,3%) e autodeclarada branca (65,9%). Mediana da idade foi de 12 anos. Identificou-se 6,7% de casamentos consanguíneos. Frequência de genitores com idade avançada (maior que 40 anos) no nascimento foi menor (p=0,002*) que a observada na população. Já o histórico familiar de atraso do neurodesenvolvimento (p<0,0001*), idade materna de risco para cromossomopatias (p=0,019*), histórico de complicações gestacionais (p<0,0001*) e nascimento prematuro (p=0,002*) tiveram frequências maiores que o esperado. Parto cesáreo foi relatado em 44,8% dos casos. Exposição e/ou consumo de álcool, tabaco e outras drogas na gestação foi de 8%. Necessidade de fototerapia, registro de Apgar inferior a 7 no 1º e no 5º minutos e tempo de permanência na maternidade superior a 5 dias foram registrados em 37,5%, 20% e 50% dos pacientes, respectivamente. A prevalência de atraso em alguma fase do neurodesenvolvimento motor variou de 81,5% (idade em que sentou sozinho/não sentou) a 96,2% (idade em que andou/não andou). Apesar da ausência de DDC, revisão bibliográfica realizada aponta que os testes genéticos, diferentemente do recomendado atualmente, devem ser aplicados em qualquer idade e quadro clínico de DNTM; Abstract: Neuronal injuries of gestational, obstetric or perinatal origin cause the Cerebral Palsy (CP). Hypoxia, hypoglycemia, trauma, hemorrhage, infections, exposure to chemical substances and genetic changes, such as aromatic amino acid decarboxylase deficiency (AADCD), triggered the neuronal injuries. AADCD is a rare disease, with an autosomal recessive pattern and with more than 580 genetic variants already described. The main clinical manifestations of AADCD are oculogyric crises, hypotonia, autonomic changes, neurodevelopmental disorders and motor disorders (NDTM). The diagnosis of AADCD, normally clinical confirmed by biochemical and genetic tests. Genetic analyzes carried out by next generation sequencing (NGS) make it possible to identify new gene variants. Regarding the treatment of AADCD, the available drugs have limited effectiveness in mild cases. However, gene therapy recently developed and approved in Brazil (eladocageno exuparvoveque) demonstrates promising results including moderate and severe clinical conditions. The objective of this research was to determine possible cases of AADCD as well as characterize the sociodemographic and clinical profile of patients with CP/NDTM. Using cells from the oral mucosa, a genetic panel (121 genes) carried out, using NGS, in 44 patients with NDTM cared for by an Association of Parents and Friends of Disabled People located in a municipality in the western region of Paraná, Brazil. The results, described quantitatively, were analyzed using the chi-square test (p<0.05*) to evaluate the association between the categorical variables and their respective observed and expected frequencies. The Research Ethics Committee of the Federal University of Paraná (approval opinion n º 6.568.371 and C.A.A.E. 74574323.1.0000.0102) approved this research. Genetic panel showed missing results to AADC gene for all patients. However, one participant presented heterozygous genetic alteration unrelated to AADCD and considered of uncertain clinical significance (gechr6:161,973,300-166,167,591, CNV-deletion of 4.2 Mb in 6q26q27). Sample characterized by predominantly male participants (59.1%), under the age of 18 (52.3%), per capita family income of one minimum wage (59.3%) and self-declared white (65.9%). Median age was 12 years. Identified 6.7% of consanguineous marriages. The frequency of parents with advanced age (over 40 years old) at birth was lower (p=0.002*) than that observed in the population. Family history of neurodevelopmental delay (p<0.0001*), maternal age at risk for chromosomal defects (p=0.019*), history of gestational complications (p<0.0001*) and premature birth (p=0.002*) had higher frequencies than expected. The 44.8% of cases reported cesarean delivery. Exposure and/or consumption of alcohol, tobacco and other drugs during pregnancy was 8%. The 37.5%, 20% and 50% of patients, respectively, reported need for phototherapy, Apgar score of less than 7 in the 1st and 5th minutes and length of stay in the maternity ward of more than 5 days. The prevalence of delay in some phase of motor neurodevelopment ranged from 81.5% (age at which he sat alone/did not sit) to 96.2% (age at which he walked/did not walk). Despite the absence of AADCD, a bibliographic review carried out indicates that genetic tests, currently not recommended, should applied at any age and clinical condition of NDTM Orientador: Prof. Dr. Edivan Rodrigo de Paula Ramos; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Bioquímica e Biologia Molecular. Defesa : Palotina, 11/12/2024; Inclui referências

Aplicação de protocolo para a obtenção dos concentrados plasma rico em plaquetas (PRP) e fibrina rica em plaquetas (PRF) para o desenvolvimento de curativos cutâneos em modelo animal

Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT

Aplicação de protocolo para a obtenção dos concentrados plasma rico em plaquetas (PRP) e fibrina rica em plaquetas (PRF) para o desenvolvimento de curativos cutâneos em modelo animal Resumo: Feridas na pele são lesões comuns que comprometem a qualidade de vida e geram altos custos nos sistemas de saúde. O tratamento geralmente envolve o uso de curativos mecânicos, biológicos ou artificiais. Objetivo: Este estudo teve como objetivo desenvolver curativos para feridas baseados em concentrados de plaquetas, especificamente plasma rico em plaquetas (PRP) e a fibrina rica em plaqueta (PRF), e avaliar sua eficácia no tratamento de feridas cutâneas em ratos Wistar. Metodologia: Os animais foram divididos em quatro grupos (n = 64/grupo), tratados com carbopol (controle negativo), PRP + carbopol, PRF + carbopol, ou PRF + CaCl2 + carbopol. As análises das feridas foram realizadas nos dias 3, 7, 14 e 21, considerando a área da ferida, taxa de contração e histopatologia do reparo tecidual. Resultados: Os resultados indicaram que o curativo à base de PRF foi mais eficaz na aceleração do fechamento das feridas nos estágios iniciais do reparo tecidual (até o dia 7). Nos estágios posteriores (dias 14 e 21), o PRF continuou a auxiliar significativamente no processo de colagenização e reparo tecidual. Por outro lado, o grupo tratado com PRF + CaCl2 mostrou uma resposta inflamatória mais pronunciada nos primeiros dias, acompanhada de maior formação de crostas (necrose), mas essa resposta inflamatória diminuiu após o dia 14. Conclusão: O curativo à base de PRF mostrou-se eficaz tanto na aceleração do fechamento inicial quanto no apoio ao reparo tecidual em fases posteriores, demonstrando potencial para ser utilizado em terapias avançadas para o tratamento de feridas cutâneas.; Abstract: Cutaneous wounds are common injuries that compromise quality of life and generate high costs for health systems. Treatment usually involves the use of mechanical, biological or artificial dressings. Objective: This study aimed to develop wound dressings based on platelet concentrates, specifically platelet-rich plasma (PRP) and platelet-rich fibrin (PRF), and to evaluate their efficacy in the treatment of skin wounds in Wistar rats. Methodology: The animals were divided into four groups (n = 64/group), treated with carbopol (negative control), PRP + carbopol, PRF + carbopol, or PRF + CaCl2 + carbopol. Wound analyses were performed on days 3, 7, 14 and 21, considering the wound area, contraction rate and histopathology of tissue repair. Results: The results indicated that the PRF-based dressing was more effective in accelerating wound closure in the early stages of tissue repair (up to day 7). In the later stages (days 14 and 21), PRF continued to significantly aid in the process of collagenization and tissue repair. On the other hand, the group treated with PRF + CaCl2 showed a more pronounced inflammatory response in the first days, accompanied by increased crust formation (necrosis), but this inflammatory response decreased after day 14. Conclusion: The PRF-based dressing was effective both in accelerating initial closure and in supporting tissue repair in later stages, demonstrating potential for use in advanced therapies for the treatment of cutaneous wounds. Orientadora: Dra. Kádima Nayara Teixeira; Coorientadora: Dra. Ana Carla Zarpelon Schutz; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Celular. Defesa : Palotina, 30/08/2024; Inclui referências; Área de concentração: Bioquímica e Biologia Molecular

Atividade antimicrobiana e compostos bioativos dos extratos liofilizados do cogumelo gigante Macrocybe titans (H.E Bigelow & Kimbr)

Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 GMT

Atividade antimicrobiana e compostos bioativos dos extratos liofilizados do cogumelo gigante Macrocybe titans (H.E Bigelow & Kimbr) Resumo: Os fungos são conhecidos como produtores de muitos compostos químicos bioativos, sintetizados em diferentes fases de seus ciclos de vida. Os basidiomicetos são consumidos rotineiramente como alimentos nutracêuticos em muitas culturas orientais. Os compostos bioativos são produzidos tanto nos basidiomas, quanto no micélio vegetativo destes organismos. O objetivo principal desse trabalho foi investigar a ação antibacteriana de diferentes extratos obtidos a partir dos basidiomas de Macrocybe titans, e a caracterização química dos compostos fenólicos. Quatro metodologias de extração foram realizadas a partir da biomassa seca do isolado de M. titans denominado MT31: Banho de ultrassom, Ponteira ultrassônica, Extração com agitação em Shaker e Extração estática a frio. Os extratos liofilizados foram submetidos à testes de atividade biológica contra as bactérias Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Os melhores resultados de inibição bacteriana obtidos pelo teste de disco-difusão foram observados contra S. aureus e K. pneumoniae, com tamanho médio de halo de inibição de 27,8 e 23,1 mm, respectivamente. As análises de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) demonstram uma marcante atividade antimicrobiana para todos os extratos testados. S. aureus foi a bactéria mais suscetível à ação do extrato com a CIM de 0,99 mg/mL. Através da (CBM) foi possível confirmar também a atividade bactericida mínima dos extratos em relação às cepas bacterianas testadas. Foram realizadas análises de determinação de fenólicos totais, flavonoides e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) de todos os extratos. Os extratos denominados AgBu (10,6 mg/g) e ActPu (2,9 mg/g) apresentaram elevada taxa de compostos fenólicos e flavonoides respectivamente. Os resultados das análises por CLAE demonstram que o isolado MT31 produz compostos que podem estar relacionados com a inibição do crescimento e desenvolvimento das bactérias. Foram identificados e quantificados oito compostos fenólicos, sendo o mais predominante em todos os extratos o ácido clorogênico variando de 0,9302 a 0,4775 mg/g, para ActBu e AgSK, respectivamente. Adicionalmente, realizou-se ensaios de padronização de condições de amplificação do material genético, e testes de anelamento de primers para a avaliação preliminar da ativação da expressão de genes relacionados com a produção de Peptídeos Antimicrobianos (PAMs) pela técnica de RT-qPCR, embora ainda preliminares, demonstraram um sinal tardio de amplificação para o gene DLP2 (defensin-like protein) em micélio desafiado com S. aureus, quando comparado com a amostra controle.; Abstract: Fungi are known to produce many bioactive chemical compounds, synthesized at different stages of their life cycles. Basidiomycetes are routinely consumed as nutraceutical foods in many eastern cultures. Bioactive compounds are produced both in the basidiomes and in the vegetative mycelium of these organisms. Bioactive compounds are produced both in the basidiomes and in the vegetative mycelium of these organisms. The main objective of this work was to investigate the antibacterial action of different extracts obtained from the Macrocybe titans basidiomes, and the chemical characterization of the phenolic compounds. Four extraction methodologies were performed from the dry biomass of the M. titans isolate called MT31: Ultrasonic bath, Ultrasonic tip, Extraction with shaking in Shaker, and Cold static extraction. The lyophilized extracts were submitted to tests of biological activity against the bacteria Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Klebsiella pneumoniae. The best bacterial inhibition results obtained by the disk-diffusion test were observed against S. aureus and K. pneumoniae, with an average size of the inhibition halo of 27.8 and 23.1 mm, respectively. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) analyses demonstrate a marked antimicrobial activity for all tested extracts. S. aureus was the bacteria most susceptible to the action of the extract with a MIC of 0.99 mg/mL. Through (MBC) it was also possible to confirm the minimum bactericidal activity of the extracts to the bacterial strains tested. Analyzes were performed to determine the total phenolics, flavonoids, and High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) of all extracts. The extracts called AgBu (10.6 mg/g) and ActPu (2.9 mg/g) showed a high rate of phenolic compounds and flavonoids, respectively. The results of HPLC analyses demonstrate that the MT31 isolate produces compounds that may be related to the inhibition of bacterial growth and development. Eight phenolic compounds were identified and quantified, the most prominent in all extracts being chlorogenic acid ranging from 0.9302 to 0.4775 mg/g for ActBu and AgSK, respectively. Additionally, tests were carried out to standardize conditions for amplification of the genetic material, and primer annealing tests for the preliminary evaluation of the activation of the expression of genes related to the production of Antimicrobial Peptides (AMPs) by the RT-qPCR technique, although still preliminary, demonstrated a late amplification signal for the DLP2 gene (defensin-like protein) in mycelium challenged with S. aureus, when compared with the control sample. Orientador: Prof. Dr. Fábio Rogério Rosado; Coorientador: Prof. Dra. Adriana Fiorini Rosado; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Bioquímica e Biologia Molecular. Defesa : Palotina, 09/12/2022; Inclui referências: p. 77-84

Expressão gênica de peptídeos antimicrobianos de Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) submetidoa desafio séptico com Aeromonas hydrophila

Sun, 01 Jan 2023 00:00:00 GMT

Expressão gênica de peptídeos antimicrobianos de Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) submetidoa desafio séptico com Aeromonas hydrophila Resumo: A aquicultura vem ganhando destaque no cenário atual. A produção de camarão, principalmente de água doce, são atividades em expansão devido ao importante valor econômico. A espécie Macrobrachium rosenbergii (De Man 1879), conhecido como camarão gigante de água doce, destaca-se por ser um dos crustáceos mais importantes economicamente por possuir elevado valor de mercado, e dessa forma, é produzido em larga escala em diferentes partes do mundo. Em seu ambiente de produção, o camarão está exposto a uma infinidade de microrganismos benéficos ou patógenos que podem onerar os sistemas de produção fazendo com que a cultura do camarão esteja ameaçada. Pequenas cadeias de aminoácidos denominados de peptídeos antimicrobianos (PAMs) são secretados e reagem de forma ativa no combate a infecções adversas e são eficientes na eliminação dos patógenos. O hepatopâncreas é um órgão essencial presente nos invertebrados, considerado como fonte de moléculas imunes. Este trabalho teve como objetivo avaliar e comparar a expressão de genes para PAMs, no hepatopâncreas de camarões adultos de M. rosenbergii em resposta a injúria séptica com a bactéria Aeromonas hydrophila nos tempos de 0, 12 e 24 horas após inoculação. Os experimentos foram realizados na Universidade Federal do Paraná (UFPR - Setor Palotina). Os animais foram avaliados quanto ao tempo de coagulação da hemolinfa como parâmetro para avaliar a sanidade dos animais utilizados nos experimentos. A bactéria A. hydrophila foi avaliado por testes bioquímicos e morfológicos, sendo caracterizada como A. hydrophila com teste negativo para indol. Nas análises moleculares, o perfil transcricional de genes relacionados com os PAMs foram analisados através da técnica de RT-PCR quantitativa e semiquantitativa e as proteínas do órgão foram extraídas e visualizadas em gel de poliacrilamida. O gene da ?-actina, utilizado como normalizador da expressão gênica demonstrou estar presente em todas as condições testadas. Os resultados indicaram que os genes, Pellino-1 e ALF-6 foram expressos em maior quantidade com 12 horas após desafio séptico com a bactéria, enquanto para Crustina na presença da bactéria, houve a repressão do gene (tempo 12 e 24 horas após inoculação). O gene ALF-6 apresentou uma super expressão com fold change de 17x, apontando um papel específico no combate a infecção causada por A. hidrophila. Portanto, foi possível observar em nosso trabalho que o hepatopâncreas foi capaz de expressar os PAMs aqui estudados, regulando a expressão dos genes nos diferentes tempos avaliados para os animais desafiados, como esperado, validando a presença de um sistema imunológico respondendo a infecções por organismos patogênicos, como a A. hydrophila. Faz-se necessários estudos complementares através de técnicas bioquímicas mais sofisticadas, para que a imunologia de M. rosenbergii possa ser mais bem compreendida.; Abstract: Aquaculture has been gaining prominence in the current scenario. Shrimp production, mainly freshwater, is an expanding activity due to its important economic value. The species Macrobrachium rosenbergii (De Man 1879), known as giant freshwater shrimp, stands out for being one of the most economically important crustaceans for having a high market value, and therefore, it is cultivated on a large scale in different parts of the world. In their production environment, shrimp are exposed to a multitude of beneficial microorganisms or pathogens that can burden production systems, making shrimp culture endangered. Small chains of amino acids called antimicrobial peptides (AMPs) are secreted and react actively to combat adverse infections and are efficient in eliminating pathogens. The hepatopancreas is an essential organ present in invertebrates, considered as a source of immune molecules. This work aimed to evaluate and compare the expression of genes for AMPs in the hepatopancreas of adult M. rosenbergii shrimp in response to septic injury with the bacterium Aeromonas hydrophila at 0, 12 and 24 hours after inoculation. The experiments were carried out at the Universidade Federal do Paraná (UFPR - Setor Palotina). The animals were evaluated regarding the hemolymph clotting time as a parameter to assess the health of the animals used in the experiments. The bacterium A. hydrophila was evaluated by biochemical and morphological tests, being characterized as A. hydrophila with negative test for indole. In the molecular analyses, the transcriptional profile of genes related to the AMPs were analyzed using the quantitative and semi-quantitative RT-PCR technique and the organ proteins were extracted and visualized on a polyacrylamide gel. The ?-actin gene, used as a gene expression normalizer, proved to be present in all conditions tested. The results indicated that the genes Pellino-1 and ALF-6 were expressed in greater quantity 12 hours after septic challenge with the bacteria, while for Crustina in the presence of the bacteria, there was gene repression (time 12 and 24 hours after inoculation). The ALF-6 gene showed an overexpression with a fold change of 17x, pointing to a specific role in combating the infection caused by A. hydrophila. Therefore, it was possible to observe in our work that the hepatopancreas was able to express the AMPs studied here, regulating gene expression at different times evaluated for the challenged animals, as expected, validating the presence of an immune system responding to infections by pathogenic organisms, such as A. hydrophila. Complementary studies are necessary through more sophisticated biochemical techniques, so that the immunology of M. rosenbergii can be better understood. Orientador: Prof. Dr. Fabio Rogério Rosado; Coorientador: Prof. Dr. Flavio Augusto Vicente Seixas; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Multicêntrico em Bioquímica e Biologia Molecular. Defesa : Palotina, 28/07/2023; Inclui referências: p. 79-90; Área de concentração: Bioquímica e Biologia Molecular