https://hdl.handle.net/1884/39848 ver Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia Fri, 05 Jun 2026 02:26:58 GMT 2026-06-05T02:26:58Z https://hdl.handle.net/1884/63348 Construção de um controle interno derivado de bacteriófago para utilização em um teste de detecção do vírus da Hepatite C baseado em PCR em tempo real Resumo: A hepatite C hoje representa um sério problema de saúde pública no Brasil e no mundo. Pelo menos 3% da população mundial está infectada. Dos casos existentes, 15% são curados e 85% tornam-se crônicos. 20% dos crônicos evoluem para cirrose hepatica e 4% para formas mais graves de doenças do fígado. Não há vacinas disponíveis e os tratamentos usados são de eficácia limitada. Desta forma um diagnóstico correto é essencial e somente a utilização de técnicas bem padronizadas e monitoradas com controles internos podem trazer esta garantia e assegurar a interpretação conclusiva dos achados obtidos evitando a liberação de resultados falso-positivos ou falso-negativos que podem comprometer um diagnóstico final. Baseando-se nestas informações foi feita a proposta deste trabalho cujo objetivo principal foi o desenvolvimento de um controle interno derivado de um bacteriófago estável e não infeccioso para um teste de detecção do vírus da hepatite C baseado em PCR em tempo real. Este controle por ser um vírus RNA como o HCV, pode controlar a metodologia desde a extração até a amplificação. Na construção desse controle foi utilizado o RNA comercial do bacteriófago MS2. O genoma inteiro do fago amplificado por PCR foi inserido no plasmídeo pGEM®-T Easy originando o pGEM®-T Easy - MS2, cuja clonagem produziu quantidade suficiente do genoma para a contrução do pET-47b(+) - MS2. Neste plasmídeo foi inserido, no gene da replicase do MS2, uma sequência sintética com 144 bases derivada da região 5' UTR do HCV originando o pET-47b(+) - MS2 - SS. Nesta sequência algumas bases foram alteradas permitindo o desenho de uma sonda para distinguir na PCR em tempo real o controle interno do HCV. Este plasmídeo foi transformado na bactéria BL21(DE3)pLyS e foi usado para expressar o bacteriófago MS2 recombinante que é o controle interno competitivo (CIC). Simultaneamente, expressou-se o MS2 a partir do vetor pET-47b(+) - MS2 que serviu como padrão na quantificação do M 2 recombinante e que também foi testado como um controle nterno não competitivo na PCR em Tempo Real. Padronizou-se reações multiplex "two step" e "one step" para as combinações CIC/HCV usando os mesmos "primers" para amplificar o HCV e o CIC e sondas para distinguir os dois alvos. Para as combinações MS2/HCV utilizou-se "primers" e sondas específicas para cada um dos alvos. Foram estudadas diversas concentrações destes controles e definiu-se que 0,025 PFU eq. do CIC e 0,1 PFU do MS2 são as quantidades ideais para serem adicionadas à amostra clínica antes de extração do RNA, porque não interferem na detecção de amostras com cargas virais altas e baixas. Foram conduzidos também estudos para avaliar-se a estabilidade e verificou-se que a estocagem a 4ºC tanto do CIC como do MS2 garante a manutenção da carga viral ao longo do tempo analisado. Portanto o presente trabalho mostrou a viabilidade técnica do desenvolvimento e da utilização de dois controles internos em uma metodologia diagnóstica e abriu perspectivas para a criação de novos controles, uma vez que os plasmídeos construídos podem servir como base para o desenvolvimento de controles específicos para metodologias diagnósticas de outras doenças causadas por vírus RNA.; Abstract: Hepatitis C is a serious public health problem in Brazil and in the world. At least 3% of world population is infected, there is no vaccine available and the treatment used is of limited effectiveness. Around 85% of patients evolve to chronic phase, 20% of them develop liver cirrhosis and 4% other serious hepatic diseases. In this way a diagnostic tool with high sensitivity and specificity and quality control measures are instruments to ensure the correct interpretation of the diagnosis and prevention of false positives and false negatives results. Therefore the main objective of this work was to develop a stable internal control derived from non-infectious bacteriophage for hepatitis C virus detection test based on real-time PCR. This control is a RNA virus that can control the methodology from extraction to amplification. In the construction of this control it was used a commercial bacteriophage MS2 RNA. The entire genome of the phage amplified by PCR was inserted into plasmid pGEM®-T Easy resulting in the pGEM®-T Easy - MS2, which produced enough genome for the construction of pET-47b(+) - MS2. It was inserted into the MS2 replicase gene a synthetic sequence of 144 bases derived from 5' UTR region of HCV resulting in the pET-47b(+) - MS2 - SS. In this sequence a few bases were exchanged allowing the design of a probe to distinguish in the real-time PCR the internal control from HCV. This plasmid was transformed in E. coli BL21(DE3)pLyS that expressed the recombinant bacteriophage MS2, the competitive internal control (CIC). At the same time the wild type MS2 was expressed from the pET-47b(+) - MS2 and used as the standard quantification of recombinant MS2 (CIC). Wild type MS2 was also tested as a non-competitive internal co trol in real-time PCR. Multiplex reactions "two step" and "one step" were standardized for combinations of CIC/HCV using the same primers to amplify the HCV and CIC and probes to distinguish the two targets. For the combination MS2/HCV we used primers and probes specific for each target. We studied different concentrations of these controls and set 0.025 PFU eq. of CIC and 0.1 PFU of MS2 as the ideal amount for be added to the clinical sample prior to extraction because they do not interfere with the detection of high and low viral loads samples. We conducted studies to evaluate the stability of phage solution and found that the storage at 4°C of both CIC and the MS2 ensures the viral load maintence over the assessed time. Therefore this study has demonstrated the technical feasibility of the development and use of two internal controls in a diagnostic method and allows the creation of other controls since the plasmids may serve as a basis for developing controls for specific diagnostic methods for other RNA viral diseases. Orientador : Prof. Dr. Marco Aurélio Krieger; Coorientadora : Profa. Dra. Daniela Parada Pavoni; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 02/03/2010; Bibliografia: fls. 178-185 Fri, 01 Jan 2010 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/63348 2010-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/80917 Desenvolvimento de bioprocesso para a produção de esporos termorresistentes de Bacillus atrophaeus Resumo: A esterilização é de fundamental importância no controle das infecções dos serviços de saúde. Falhas nesse processo podem levar à transmissão de doenças infecciosas. Para assegurar a eficiência da esterilização, as principais instituições normativas mundiais de saúde recomendam o uso rotineiro de Indicadores Biológicos (IB) para seu monitoramento, no Brasil esta é uma exigência legal. Os consultórios odontológicos, na sua grande maioria, utilizam o calor seco como principal método de esterilização. Pesquisas demonstram que a maioria destes serviços não atende a esta exigência devido ao alto custo e à dificuldade de aquisição destes IB. Esporos do Bacillus atrophaeus são recomendados como IB para esterilização por calor seco devido à sua alta resistência térmica. Na primeira etapa deste trabalho, utilizando meios de cultura sintéticos, foram investigados aspectos de rendimento de produção e de resistência térmica dos esporos, em função da composição dos meios de cultura do inóculo, meios de esporulação e recuperação, bem como do material do suporte. O tempo de incubação do inóculo foi padronizado em 18 horas; o meio constituído de extrato de levedura, 0,8%; caldo nutriente, 0,4%; MnSO4.4H2O, 0,005%; CaCl2.6H2O, 0,005% e ágar, 3,0%, foi o que apresentou a melhor relação produtividade x facilidade no preparo. O IB embalado em frasco com papelote como suporte apresentou maior resistência térmica e permitiu melhor visualização do produto. Objetivando uma maior estabilidade do produto, a solução de acetato de cálcio 0,02M foi escolhida como diluente. A concentração 0,0015% de azul de bromotimol, com a adição de 0,1% de amido no meio de recuperação, forneceram um D160°C, em média, 7,0% maior e um Usk,160°C, em média, 5,4% maior. Um lote experimental da suspensão de esporos e um lote experimental do IB foram produzidos, e os resultados (Usk,160°-C = 37,4 ± 1,5 min e D16o°c = 5,5 ± 0,3 min) atenderam aos critérios de qualidade preconizados pelas normas internacionais. Na segunda parte, foi desenvolvida metodologia de produção de esporos termorresistentes utilizando resíduos e subprodutos agroindustriais da soja e da cana-de-açúcar como substrato. Realizou-se a seleção das matériasprimas, da técnica de cultivo, do reator e a otimização das variáveis físicas, químicas e nutricionais do cultivo. No preparo do inóculo, o melaço de soja a 4,0%, adicionado de peptona a 4,0%, proporcionou biomassa entre 8,4 x 107 a 2,1 x 1010 UFC.mL-1. A fermentação em estado sólido (FES) foi otimizada: bagaço de cana como suporte (1,0 mm como tamanho médio da partícula); melaço de soja a 2 ,0% e sais estimuladores da esporulação como substrato; 3% como taxa do inóculo (107 UFC.g1 de matéria seca); umidade inicial de 93%; pH 8,0; água como diluente, tempo de incubação de 7 dias e saco plástico como reator, fornecendo 1010 UFC.g-1 de massa seca. Resultando em um acréscimo de até 3 log e propiciando uma redução de 50% do tempo de incubação em relação à produção em ágar. A análise da resistência térmica dos esporos produzidos forneceu um D16o°c = 5,2 ± 0,2 min, superior ao preconizado pela USP (D160°C = 3,0 min).; Abstract: Effective sterilization is important in avoiding cross-infections and the transmission of infectious diseases. The Health Services’ current guidelines on infection control practices recommend regular biological monitoring of sterilizers for it is a legal requirement. Most dental and medical facilities still use dry heat sterilizers as a current practice. Researches have shown that only few dental offices apply biological monitoring of sterilization for its high cost is a hindrance to its widespread use. For dry heat sterilization, more specifically, Bacillus atrophaeus spores are recommended due to its high thermal resistance to this process. Aiming at developing a costeffective product, in the first stage of this research, aspects of their roduction effectiveness and spore thermal resistance, different compositions of sporulation and recovery synthetics culture media, and the support spore material were evaluated. The inoculum incubation time was standardized as 18 hours, and the best cost/productivity relation sporulation medium was: yeast extract, 0.8%; nutrient broth, 0.4%; MnSO4.4H2O, 0.005%; CaCl2.6H2O, 0.005% and agar, 3.0%. The inoculated strips put into sterile glass vial showed higher thermal resistance and allowed better product visualization. Calcium acetate solution 0.02 M was chosen as a diluent’s in order to maintain the product’s stability. Recovery medium with bromotimol blue, 0.0015 % and starch, 0.1%, provided a 7.0% higher D160°C and a 5.4% higher Usk,i60°c, on average. An experimental spore suspension batch was produced and the obtained results (Usk,i60°C = 37.4 ± 1.5 min and D160°C = 5.5 ± 0.3 min) met the international quality standard criteria. In the second part, a methodology for thermal resistant spore production using soybean and sugar cane by-products was developed. Different substrates, fermentation techniques, and reactors were evaluated and chemical, physical, and nutrition characteristics of the culture were optimized. An optimized inoculum medium containing 4.0% soybean molasses and 4.0% casein peptone was similar in performance to a synthetic control medium resulting in 8.4 x 107 to 2.1 x 1010 CFU.mL-1 of biomass. The SSF using sugar cane bagasse as support and soybean molasses 2 .0%, supplemented with sporulation inductor salts, was the best technique and its variable optimum values were: particle size, 1.0 mm - mean; inoculum’s size, 3% (107 CFU.g-1 dry matter), moisture content, 93%; initial substrate pH, 8.0; water as a solution base, plastic bag as a reactor, and seven days as incubation time. The high-yield spore production was about 3 log higher as compared to the control agar medium, and 1 log increase over the first SSF study. The dry-heat resistance analysis gave a D160°C-value result (5.2 ± 0.2 min), higher than the one recommended by the USP (D160°C = 3.0 min). Orientador : Carlos Ricardo Soccol; Coorientadores : Adriane B. P. Medeiros e Luciana P. S. Vandenberghe; Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 03/07/2008; Inclui bibliografia e anexos; Área de concentração: Saúde animal e humana Tue, 01 Jan 2008 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/80917 2008-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/42111 Efeito da ação antitumoral, parâmetros bioquímicos e imunitários da biomassa de Ganoderma lucidum utilizada como suplemento alimentar em ratos portadores de tumor Walker 256 Resumo: A cada ano, 10 milhões de pessoas tem diagnóstico positivo de câncer no mundo e destes 12% evoluem para morte. A estimativa é de que até o ano de 2020 serão 15 milhões de novos casos por ano (OMS, 2004). Diante disso, diversos estudos estão sendo realizados na tentativa de se identificar as possíveis causas desse aumento desordenado, das várias formas de câncer, buscam-se alternativas para tratamentos. Ganoderma lucidum é um cogumelo medicinal amplamente empregado no Oriente para o tratamento de diversas doenças, inclusive o câncer. Este trabalho tem por objetivo avaliar as propriedades farmacológicas do G. lucidum e sua ação antitumoral em organismos vivos (ratos Wistar) inoculados com Tumor Walker 256 e alimentados com ração suplementada com 25% de G. lucidum obtido por fermentação em estado sólido (ração G25). O grupo experimental constituiu de ratos Wistar de 90 dias que foram divididos em 4 grupos de acordo com o início da suplementação alimentar com a ração G25. Todos os grupos foram inoculados com Tumor Walker 256 no dia zero. O grupo Controle (GC) foi alimentado com ração normal, o grupo profilático GP iniciou a alimentação suplementada 30 dias antes da inoculação do tumor, o grupo tratamento GT iniciou a alimentação suplementada no mesmo dia da inoculação do tumor, o grupo tratamento retardado GTR iniciou a alimentação suplementada 10 dias após a inoculação do tumor. Com relação à inibição tumoral, observou-se redução significativa nos grupos GT (61%) e GTR (42%) sendo que o grupo GP também obteve valores de 35%. Como parâmetro histológico foi avaliado o índice mitótico nos diferentes grupos estudados. Observou-se no grupo controle um índice de mitose celular de 29,4 mitoses por campo no grupo tratamento esse índice foi de 6,4. Essa diferença estatisticamente significativa mostra que o grupo controle apresenta um prognóstico reservado, alta malignidade. Quando oferecida de forma terapêutica a ração suplementada com G. lucidum, observou-se a diminuição da agressividade tumoral, o índice mitótico diminuiu para 6,4. Sugere-se que prováveis princípios ativos possam ter inibida a proliferação de células malignas induzindo a apoptose. O presente estudo corrobora a percepção da comunidade científica a respeito das propriedades antitumorais do G. lucidum administrado em altas doses em suplementação animal. O caminho a ser seguido é isolar e purificar as substâncias ativas nesse processo para que no futuro possa-se ter mais uma alternativa para o combate ao câncer em seres humanos.; Abstract: Every year, 10 million people are diagnosed positive for cancer in the world, representing 12% of deaths. According to estimates of the WHO, by 2020 there will be 15 million additional cases per year (WHO, 2004). In view of this, a number of new studies have been carried out in an attempt to identify the possible causes of such disordered increase of the various forms of cancer, and alternatives for treatments are been saught. Ganoderma lucidum is a medicinal mushroom widely used in the Eastern world in the treatment of various diseases, including cancer. The present work aims at evaluating G. lucidum's pharmacological properties and its tumoral action in live organisms (Wistar rats) inoculated with Walker 256 Tumor and fed on a ration supplemented with 25% G. lucidum obtained through solid state fermentation. The experimental group consisted of 90 days old Wistar rats which were divided into 4 groups according to the day they started their food supplementation with G25 ration. All groups were inoculated with Walker 256 Tumor on day zero. The Control group (CG) was fed a normal ration, the GP group began to receive the supplemented ration 30 days before tumor inoculation, the GTR group began to receive the supplemented ration 10 days after tumor inoculation. As far as tumor inhibition is concerned, it was possible to observe a significant reduction in groups TG (61%) and GTR (42%) besides group GP also attaining values around 35%. The counting of cellular mitosis was carried out as a parameter in the various groups under study. In the control group, a 29.4 index of cellular mitosis was observed; in the treatment group this index was 6.4. This statistically significant difference shows that the control group presents a highly malignant reserved prognosis. When the ration supplemented with G. lucidum was offered as a therapeutic procedure, we observed a decrease in the tumor's aggressiveness, the mitotic index decreased to 6.4. It was possible to observe that the active principle of G. lucidum directs physiological stimuli of the cellular apoptosis to inhibit the proliferation of malign cells. The present study ratifies the feeling the scientific community has about the antitumoral activities of the G. lucidum when administered in high dosages in animal supplementation. The path to be followed is to isolate and purify the active substances in this process in order that in the future we can have another alternative for fighting cancer in humans. Orientador: Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol; Coorientadores: Dra. Rosália Rubel e Prof. Dr. Luiz Cláudio Fernandes; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 18/12/2006; Inclui referências : f.72-102; Área de concentração: Saúde Humana e Animal Sun, 01 Jan 2006 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/42111 2006-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/63283 Obtenção de peptídeos recombinantes com potencial aplicabilidade para imunodiagnóstico de Hepatite B e Hepatite C através da técnica de Phage Display Resumo: O Ministério da Saúde tem a hemovigilância como uma de suas áreas estratégicas de atuação, com o objetivo de direcionar ações visando reduzir os incidentes transfusionais, dentre os quais, devido à gravidade, podemos destacar: infecção por HBV/Hepatite B e infecção por HCV/Hepatite C, que totalizam 350 e 170 milhões de pacientes crônicos no mundo, respectivamente. Portanto, é obrigatória a realização de exames laboratoriais de alta sensibilidade para detecção destes patógenos, em todas as doações, sendo que o sangue e seus derivados não podem ser transfundidos antes da obtenção de esultados finais de triagem não-reagentes. Estima-se que o mercado mundial de kits de diagnóstico movimente cerca de 25 bilhões de dólares anualmente e o Brasil, em particular, estima-se possuir um saldo comercial negativo em reativos de diagnóstico da ordem de 200 milhões de dólares, explicitando a alta dependência do país por importações para suprir a demanda interna de diversos programas de saúde ública. Com base nestes dados, o presente trabalho foi desenvolvido para a triagem de três bibliotecas comerciais (Ph.D. 7, Ph.D. 12 e Ph.D. C7C, New England Biolabs) construídas pela técnica de Phage Display para a obtenção de peptídeos recombinantes com potencial aplicabilidade no imunodiagnóstico de hepatite B e hepatite C. Após a realização de três ciclos de seleção (bio-panning), foi realizado o seqüênciamento dos peptídeos obtidos e, através da análise dos mesmos por ferramentas de bioinformática e da realização de estudos de afinidade por ensaios imunoenzimáticos, foi possível selecionar três peptídeos de potencial aplicabilidade para testes de imunodiagnóstico do vírus da hepatite B e dez para o vírus da hepatite C.; Abstract: Aiming to direct actions in order to reduce post-transfusional incidents, such as hepatitis B and C viruses infection (which total 350 and 170 million chronic patients in the world, respectively), the Brazilian Ministry of Health has hemovigilance as one of its strategic areas of action. Therefore, it is mandatory to carry out laboratory tests of high sensitivity for the detection of these pathogens in all donations and the blood and its derivatives can not be transfused prior to obtaining final results of non-reactive screening. It is estimated that the worldwide market for diagnostic kits moves around 25 billion dollars annually and Brazil in particular, is estimated to have a negative trade balance in diagnostic reagents of 200 million dollars, which results in a high national dependence on imports to meet Brazilian demand for many public health programs. Based on these data, this work was developed in order to obtain recombinant peptides with potential applicability in the immunodiagnosis of hepatitis B and hepatitis C through the screening of three commercial libraries of random peptides (Ph.D. 7, Ph.D. 12 e Ph.D. C7C, New England Biolabs) constructed using the Phage Display technology. After performing three rounds of screening (bio-panning), all peptides screened were sequenced and the data obtained was analyzed by bioinformatics tools and immunoassays affinity studies. As a result, it was possible to select three peptides with potential applicability in immunodiagnostic tests for hepatitis B virus and ten peptides for hepatitis C virus testing. Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Krieger; Coorientadora: Prof. Dra. Daniela Parada Pavoni; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 23/02/2011; Bibliografia: fls. 134-139 Sat, 01 Jan 2011 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/63283 2011-01-01T00:00:00Z