Dissertações

Aplicação de um novo modelo de epiderme humana reconstituída in vitro para avaliação de irritantes cutâneos

Fri, 01 Jan 2021 00:00:00 GMT

Aplicação de um novo modelo de epiderme humana reconstituída in vitro para avaliação de irritantes cutâneos Resumo: O desenvolvimento de metodologias alternativas tem se mostrado cada vez maisimportante para a aplicação do princípio dos 3 Rs (Replacement, Reduction andRefinement). Dentro desse contexto, a Epiderme Humana Reconstruída (RHE –Reconstructed Human Epidemis) é um modelo capaz de simular as característicasmorfológicas, bioquímicas e fisiológicas da epiderme humana, podendo ser utilizadopara diversos fins científicos, por exemplo, na avaliação da toxicidade desubstâncias químicas. Apesar de esse modelo ter elevada aceitação no contexto datoxicologia regulatória, ele é ainda pouco adotado em pesquisas acadêmicas,principalmente devido aos altos custos, dificuldades de aquisição e limitações deinformações acerca do protocolo de construção. Frente a isso, nosso objetivo foidesenvolver um novo modelo de RHE, aqui referido como Skinvitro-RHE, por meioda análise de fatores que potencialmente influenciam culturas de RHE (i.e..recobrimento dos insertos, placa de cultivo, densidade de poros dos insertos, meiode cultura, suplementos do meio de cultura, tempo de condição submersa, umidadee idade dos doadores de queratinócitos). A partir dessa análise, elaboramos umprotocolo aberto, a fim de aumentar a acessibilidade do modelo de RHE paralaboratórios acadêmicos e estudos que não se enquadram nas condições de BoasPráticas de Laboratório (BPL). Além disso, como segundo objetivo do trabalho,avaliamos a aplicabilidade desse modelo no teste de irritação dérmica in vitro,seguindo o método OECD TG 439. A melhor condição de construção da RHE foi ageração de um modelo construído com queratinócitos neonatais, plaqueados eminsertos de alta densidade de poros e revestidos com colágeno IV. Por meio desseprotocolo de construção, obtivemos uma RHE altamente similar à epiderme humanacom as quatro camadas de diferenciação e estrato córneo bem definido (~ 7camadas, 66,7 µm de espessura). Além disso, quando exposta a marcadores dediferenciação (Queratina-10, Queratina-14, Filagrina, Involucrina), apresentoupadrão de marcação semelhante à epiderme humana. Este modelo também seenquadrou nos parâmetros de controle de qualidade preconizados pela OECD TG439 e, assim, demonstrou boa viabilidade celular (densidade óptica média em 570nm de 1,7 ± 1,08) e função de barreira (IC50 de 2,77 ± 0,53 mg/mL - Dodecil Sulfatode Sódio). A Skinvitro-RHE foi, então, avaliada quanto ao seu potencial de uso paraavaliação de irritação dérmica por meio de 15 substâncias de referência (7 irritantese 8 não irritantes), usualmente empregadas em estudos de avaliação. Os resultadosmostraram que a Skinvitro-RHE foi capaz de discriminar substâncias irritantes denão irritantes, apresentando especificidade de 85,71 %, sensibilidade de 100 % eprecisão de 93,33 %. Em conclusão, esses resultados demonstram que a Skinvitro-RHE é um modelo promissor, acessível e altamente reprodutível, que pode serutilizado para teste de irritação dérmica, bem como outras finalidades científicas pormeio de seu protocolo aberto, contribuindo para a disseminação e implementação demétodos alternativos, principalmente em setores em que esse modelo 3D ainda nãoé bem difundido.; Abstract: The development of alternative methodologies has been shown to be increasinglyimportant for the application of the principle of 3 Rs (Replacement, Reduction andRefinement). Within this context, the Reconstructed Human Epidemic (RHE) is amodel capable of simulating the morphological, biochemical and physiologicalcharacteristics of the human epidermis, and can be used for various scientificpurposes, for example, in the evaluation of the toxicity of chemical substances.Although this model is highly accepted in the context of regulatory toxicology, it is stilllittle adopted in academic research, mainly due to high costs, difficulties in acquisitionand limitations of information about the construction protocol. In view of this, ourobjective was to develop a new model of RHE, here referred to as Skinvitro-RHE,through the analysis of factors that potentially influence cultures of RHE (i.e.,coverings of the inserts, cultivation plate, pore density of the inserts, culture medium,culture medium supplements, time in submerged condition, humidity and age ofkeratinocyte donors). From this analysis, we developed an open protocol in order toincrease the accessibility of the RHE model for academic laboratories and studiesthat do not fit the Good Laboratory Practices (GLP) conditions. In addition, as asecondary objective of the study, we evaluated the applicability of this model in thedermal irritation test in vitro, following the OECD TG 439 method. The bestconstruction condition for the RHE was the generation of a model constructed withneonatal keratinocytes, plated in high-density pore inserts and coated with collagenIV. Through this construction protocol, we obtained an RHE highly similar to thehuman epidermis with the four layers of differentiation and well-defined stratumcorneum (~ 7 layers, 66.7 µm thick). In addition, when exposed to differentiationmarkers (Keratin-10, Keratin-14, Filaggrin, Involucrin), it presented a marking patternsimilar to the human epidermis. This model also fits the quality control parametersrecommended by OECD TG 439 and, thus, demonstrated good cell viability (meanoptical density at 570 nm of 1,7 ± 1,08) and barrier function (IC50 of 2,77 ± 0,53mg/ml - Sodium Dodecyl Sulfate). The Skinvitro-RHE was then evaluated for itspotential use for the evaluation of dermal irritation using 15 reference substances (7irritants and 8 non-irritants), usually used in evaluation studies. The results showedthat the Skinvitro-RHE was able to discriminate between irritating and non-irritatingsubstances, with a specificity of 85.71%, sensitivity of 100% and precision of 93.33%.In conclusion, these results demonstrate that the Skinvitro-RHE is a promising,accessible and highly reproducible model, which can be used for skin irritationtesting, as well as other scientific purposes through its open protocol, contributing tothe dissemination and implementation of alternative methods, especially in sectorswhere this 3D model is not yet widespread. Orientadora: Profa. Dra. Daniela Morais Leme; Coorientadora: Dra.Cynthia Bomfim Pestana; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 29/03/2021; Inclui referências

Estudo de algumas características biológicas dos portadores do antígeno Austrália em amostras da populaçao da Bahia e de Sergipe

Sat, 01 Jan 1977 00:00:00 GMT

Estudo de algumas características biológicas dos portadores do antígeno Austrália em amostras da populaçao da Bahia e de Sergipe Orientador: Prof. Dr. Newton Freire-Maia; Dissertaçao (mestrado) -Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em Genética Humana; Inclui referências: p. 70-86

O papel do miR 1257 no câncer de mama

Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 GMT

O papel do miR 1257 no câncer de mama Resumo: O câncer de mama é a neoplasia mais frequentemente diagnosticada em mulheres e a principal causa de morte por câncer em mulheres. Aproximadamente 90% das variantes genéticas associadas ao câncer de mama estão localizadas em regiões não codificadoras, incluindo sequências alvo de microRNAs (miRNAs). Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) localizados na região 3'UTR de alvos de miRNAs podem interferir com o seu sítio de ligação, reduzindo sua efetividade ou abolindo a repressão mediada pelo miRNA. Entre as predições obtidas previamente no trabalho in silico, foi verificada que a região 3’UTR do gene MDM4 é alvo de interação com microRNAs através de miRSNPs. Por ser um regulador negativo da atividade de transativação da proteína supressora tumoral p53, MDM4 assim como seu homólogo estrutural, MDM2 exercem um importante papel pró-oncogênico em várias neoplasias, dentre elas o câncer de mama. Dessa forma, os objetivos do presente trabalho foram investigar o papel do miR-1257, na interação com o seu alvo predito miRSNP rs10900596 T>C localizado em 3’UTR de MDM4, bem como avaliar os efeitos da radiação UV e da superexpressão do miR-1257 na expressão relativa dos genes MDM2, MDM4 e suas isoformas, além de verificar quais parâmetros de malignidade nas linhagens tumorais de mama ZR-75-1 e MDA-MB-231 podem ser modificados pela ação do miR-1257. A análise de interação empregando o sistema repórter luciferase demonstrou que o miR-1257 interage com a região alvo contendo o alelo C do rs10900596 de MDM4 (p= 0,0175) preconizada pelo estudo de bioinformática mas essa ligação não é afetada pela variação alélica do miRSNP presente nesse sítio de ligação. O miR-1257 também possui sítios de ligação em 3’UTR de MDM2. Os resultados obtidos mostraram que o miR1257 afeta a expressão relativa de MDM2 na linhagem ZR-75-1. A radiação ultravioleta aumentou a expressão relativa da isoforma MDM4-211 na linhagem ZR-75-1, que sem o efeito genotóxico não apresentava essa isoforma. Observou-se um efeito sinérgico da combinação do miR-1257 e da UV na expressão das isoformas de MDM4, especialmente da isoforma MDM4-FL nas linhagens tumorais de mama contrastantes ZR-75-1 e MDA-MB-231. O miR1257 apresenta um efeito supressor tumoral no câncer de mama, uma vez que essa molécula foi capaz de reduzir a viabilidade celular, aumentar as taxas de morte celular e interferir negativamente na proliferação de células de linhagens de câncer de mama distintas; Abstract: Breast cancer is the most frequently diagnosed neoplasm in women and the leading cause of cancer death in women. Approximately 90% of the genetic variants associated with breast cancer are located in non-coding regions, including target sequences of microRNAs (miRNAs). Single nucleotide polymorphisms (SNPs) located in the 3'UTR region of miRNA targets can interfere with their binding site, reducing their effectiveness or abolishing miRNAmediated repression. Among the predictions obtained previously in the in silico study, it was verified that the 3'UTR region of the MDM4 gene is the target of interaction with microRNAs through miRSNPs. As a negative regulator of the transactivation activity of the tumor suppressor protein p53, MDM4, as well as its structural homologue MDM2, plays an important pro-oncogenic role in several neoplasms, including breast cancer. Thus, the objectives of the present study were to investigate the role of miR-1257 in the interaction with its predicted target miRSNP rs10900596 T>C located in 3'UTR of MDM4, as well as to evaluate the effects of UV radiation and overexpression of miR-1257 in the relative expression of the genes MDM2, MDM4 and their isoforms, in addition to verifying which parameters of malignancy in the breast tumor lines ZR-75-1 and MDA-MB-231 can be modified by the action of this miRNA. The interaction analysis using the luciferase reporter system showed that miR-1257 interacts with the target region containing the C allele of MDM4 rs10900596 (p=0.0175) predicted by the bioinformatics study, but this binding is not affected by the allelic variation of the miRSNP present at this binding site. miR-1257 also has binding sites on the 3'UTR of MDM2. The results obtained showed that miR-1257 affects the relative expression of MDM2 in the ZR-75-1 cell line. Ultraviolet radiation increased the relative expression of the MDM4-211 isoform in the ZR-75-1 cell line, which, without the genotoxic effect, did not present this isoform. A synergistic effect of the combination of miR-1257 and UV was observed on the expression of MDM4 isoforms, especially the MDM4-FL isoform in the contrasting breast tumor lines ZR-75-1 and MDA-MB-231. miR-1257 has a tumor suppressor effect on breast cancer, since this molecule was able to reduce cell viability, increase cell death rates and negatively interfere with the proliferation of cells from different breast cancer lineages Orientadora: Profa. Dr.ª Karin Braun Prado; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 30/09/2022; Inclui referências

Variante K da butirilcolinesterase e diabetes mellitus

Thu, 01 Jan 2004 00:00:00 GMT

Variante K da butirilcolinesterase e diabetes mellitus Resumo: A butirflcolínesterase humana (BChE; EC 3.1.1.8), enzima produzida no fígado, presente no plasma e principais sistemas do organismo, ainda não teve sua função biológica esclarecida. É codificada pelo gene BCHE, cuja variante K confere redução de cerca de 33% na atividade, em relação ã enzima usual. O objetivo deste trabalho foi investigar associação da variante K com o diabetes melliíus dos tipos 1 e 2. A amostra de 249 pacientes (103 do tipo I e 146 do tipo 2) foi genotipada quanto à variante K por JPCR-RFLP e PCR-SSCA. Analisaram-se variáveis antropométricas, bioquímicas, fenófipos do gene CHE2, pressões arteriais, idade de aparecimento da doença, sexo e origem étnica. Uma amostra de 944 doadores de sangue serviu de controle para as comparações das freqüências alélicas e genotipieas. Em DM do tipo 1, os principais resultados foram: 1) As freqüências alélicas e genotipieas (K = 21,84% ± 2,88%; 61,17% UU, 33,98% UK e 4,85% KK) não diferem daquelas dos controles; 2) Nos pacientes, o fpnpo UK+KK mostrou menor idade média de aparecimento da doença (11,67 ± 1,00) do que o grupo usual (15,25 ± 0,96; p = 0,015) e menor atividade média da BChE (4,62 ± 0,16 KU/L) do que o usual (5,42 ± 0,16 KU/L; p < 9 x IO*4); 3) Á freqüência do alelo K (30,61% ± 4,66%) nos diabéticos com idade de aparecimento da doença antes dos 13 anos (mediana) é significativamente mais alta do que naqueles com essa idade maior ou igual a 13 anos (12,75% ± 3,30%; p = 0,002)) e do que nos controles (17,53 ± 0,88%; p = 0,0011). Indivíduos com o alelo K parecem apresentar maior susceptibilidade ao aparecimento do DM do tipo 1 antes dos 13 anos (odds raüo —2,40; de 1,35 a 4,28, com IC de 95%). Esses dados são reforçados pelos que relacionam atividade baixa da BChE e auto-imunidade. Em DM do tipo 2, os principais resultados foram: 1) As freqüências alélicas e genotipieas (K = 17,12% ± 2,20%; 69,18% UU, 27,40% UK e 3,42% KK) não diferemXV daquelas dos controles* contrariando resultados de HASHIM e cols, ( 2001) e estando de acordo com os de JOHANSEN e cols. (2003); 2) Nesses pacientes, o gpipo com a variante K mostrou maior média de razão cintura-quadrií (RCQ = 0,97 ± 0,01) do que o usual (0,93 ± 0,01; p = 0,023) e menor atividade média da BChE (5,68 ± 0*18 KU/L) do que o usual (633 ± 0*15 KU/L; p < 0,02); 3) A RCQ, em média, aumenta com os triglicerideos, o índice de massa corporal (1MC), em homens e diabéticos com a variante K; 4) Â freqüência dessa variante no grupo com Síndrome Metabólica (22,02% ± 3,20%) é maior (p = 0,027) que naquele sem SM (11,22% ± 3,19%), sugerindo que, em DM do tipo 2, a variante K predispõe para maior RCQ e, em conseqüência, para maior risco de Síndrome Metabólica, já que a RCQ é usada no diagnóstico dessa síndrome.XVI; Abstract: Tiie human butyrylchotinesterase (BChE; EC 3.1.1.8) - enzyme produced in líver and found in píasma and in the rnain body sysíems - has not yet liad rts bioíogical function deiined. It is eoded by the BCHE gene whose K variant leads to approximately 33% reduction in activity in relation to the usual enzyme. The purpose of tiiis work was to investigaíe associations between the K variant and diabetes mellitus (types 1 and 2). The 249 patient sanaple (103 type 1 and 146 type 2) was genotyped for the K variant by PCR-RFLP and PCR-SSCA. Many variables were analyzed (aeíhropomeíric, biochemical, CHE2 gene phenoíypes, arterial pressures, age of disease appearance, sex and ethnic origin). A sample of 944 blood dooors served as control for cotnparing allele and genotype frequencies. The main resulís for type 1 DM were: 1) The allele and genotype frequencies (K = 21X4% ± 2.88%; 61.17% UU, 33.98% UK and 4.85% KK) did not diifer írom those of the Controls; 2) Io these palíents, ífae UK+KK group showed lower mean age of disease onset (11.67 ± 1.00) than the usual group (15.25 ± 0.96; p = 0.015) and lower mean BChE activity (4.62 ±0.16 KU/L) than the usual gronp (5.42 ± 0.16 KUÍL; p < 9 x IO*4); 3) The K allele frequeacy (30.61% ± 4.66%) in diabetícs wíth age of disease onset less than 13 years (median value) is sígmficaiitly higher tlian in those with íbis age greater than or equal to 13 years (12.75% ± 3.30%; p = 0.002) and than in the Controls (17.53 ± 0.88; p — 0.001 T). Individuais with the K variant secni to have greater susceptibiility to type 1 DM onset previous to 13 years of age (odds taíio = 2.40, from 1.35 to 4.28. wifti 95% of O ). These data are reinforced by those that relate low BChE activity and auto-immuniíy. In type 2 DM, the main results were: 1) The allele and genotype frequencies (K = 17.12% ± 2.20%; 69.18% IIÜ, 27.40% UK andxvn 3.42% KK) do not differ from those of the Controls, dísagreeíng with. results froin HASHIM et aí. (2001) and in accordance with tbose from JOHANSEN eí aí. (2 0 0 3 2 ) Xn tibcsc puíiouts, tlic group wítii the K variant showed greater mean waist-Mp ratio (WHR = 0.97 ± 0.01) than the usual group (0.93 ± 0.01; p = 0.023) and lower mean BQiE activity (5.68 ± 0.18 KU/L) than Üie usual group (6.33 ±0.15 KU/L; p < 0.02); 3) The mean WHR raises with triglycerides, body mass index (BMI), in men and in diabetics with the K variant; 4) The freqaency of íhis variant in the group with the Metabolic Syndrome (22.02% ± 3.20%) is higher (p = 0.027) than in those wilhout íi (1 1 .22% ± 3.19%), suggesting that the K variant predisposes to higher WHR in type 2 DM and, conseqiientiy, to higher risk of Metabolic SyndrQnm. sioee WHR is used for the diagnosis of tfns syndrome Orientadora : Eleidi A.Chautard-Freire-Maia; Co-orientadores : Ricardo L. R. de Souza e Vânia M. de Alcântara; Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas. Curso de Pós-Graduaçao em Genética; Inclui bibliografia