https://hdl.handle.net/1884/39616 Fri, 22 May 2026 23:43:57 GMT 2026-05-22T23:43:57Z https://hdl.handle.net/1884/102115 Modificações químicas de polissacarídeos sulfatados de Ulva fasciata, U. laetevirens e Gayralia brasiliensis : fosforilação, metacrilação, atividade anticoagulante, propriedades físico-químicas e macromoleculares Resumo: Macroalgas verdes pertencentes ao gênero Ulva constituem uma fonte renovável para a obtenção de compostos bioativos. Dentre esses compostos, merecem destaque os polissacarídeos sulfatados conhecidos como ulvanas. Ulvanas F. UF e ULT caracterizadas no presente trabalho apresentaram como principal componente o um dissacarídeo composto por unidades de ulvanobíose constituída de unidades de a-L-ramnosep 3-sulfato e B-D-xilosep respectivamente. O enfoque central deste estudo está na produção de produtos fosforilados com diferentes massas molares, a partir das ulvanas de Ulva fasciata, por meio de reações de fosforilação química. Os produtos resultantes, antes e depois da fosforilação química, foram submetidos a análises químicas e espectroscópicas, bem como avaliados em relação às suas atividades anticoagulantes, propriedades físico-químicas e macromoleculares. Foi possível obter ulvanas com diversos níveis de fosfatação, alcançando um teor máximo de fosfato de 1,3% através da fosforilação em meio aquoso. Já para a fosforilação em meio orgânico, o teor máximo de fosfato obtido foi de 2,6%. Adicionalmente, realizou-se a reação de metacrilação, onde as frações UFM e GBM apresentaram graus de substituição de 0,3 e 0,5, respectivamente. Atividade anticoagulante das ulvanas e seus derivados quimicamente modificados foi examinada in vitro, por meio de análises do tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT) e do tempo de protrombina (PT). Ulvanas fosforiladas em meio aquoso exibiram uma atividade anticoagulante superior em comparação com as ulvanas nativas, e essa atividade foi mais pronunciada do que a observada para ulvanas fosforiladas em meio orgânico. As características macromoleculares das ulvanas e de seus produtos fosforilados em solução foram investigadas utilizando técnicas como cromatografia de exclusão de tamanho (HPSEC) e dicroísmo circular (CD). Os produtos fosforilados e metacrilados demonstraram alterações macromoleculares e conformacionais no polissacarídeo, decorrentes das modificações químicas aplicadas. Tanto as ulvanas nativas quanto seus derivados fosforilados e metacrilados representaram uma classe inédita de moléculas com potencial aplicação em diferentes áreas biotecnológicas.; Abstract: Green macroalgae belonging to the Ulva genus constitute a renewable source for obtaining bioactive compounds. Among these compounds, sulfated polysaccharides known as ulvanas stand out. Ulvanas F. UF and ULT characterized in this work presented as the main component a disaccharide composed of ulvanobiose units consisting of units of a-L-rhamnosep 3-sulfate and B-D-xylosep respectively. The central focus of this study lies in the production of phosphorylated products with different molecular weights from Ulva fasciata ulvans through chemical phosphorylation reactions. The resulting products, before and after chemical phosphorylation, underwent chemical and spectroscopic analyses and were evaluated for their anticoagulant activities, physicochemical properties, and macromolecular characteristics. Ulvans with varying degrees of phosphorylation were obtained, reaching a maximum phosphate content of 1.3% through aqueous phosphorylation. In contrast, the maximum phosphate content achieved through organic phosphorylation was 2.6%. Additionally, a methacrylation reaction was conducted, with UFM and GBM fractions having substitution degrees of 0.3 and 0.5, respectively. The anticoagulant activity of ulvans and their chemically modified derivatives was examined in vitro through activated partial thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (PT) analyses. Aqueously phosphorylated ulvans exhibited higher anticoagulant activity compared to native ulvans, and this activity was more pronounced than that observed for organically phosphorylated ulvans. The macromolecular characteristics of ulvans and their phosphorylated products in solution were investigated using techniques such as size-exclusion chromatography (HPSEC) and circular dichroism (CD). The phosphorylated and methacrylated products showed macromolecular and conformational changes in the polysaccharide resulting from the applied chemical modifications. Both native ulvans and their phosphorylated and methacrylated derivatives represent a novel class of molecules with potential applications in various biotechnological fields. Orientadora: Profa. Dra. Maria E. Duarte Noseda; Coorientador: Prof. Dr. Miguel Daniel Noseda; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 26/09/2023; Inclui referências Sun, 01 Jan 2023 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/102115 2023-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/101901 Efeito de solventes eutéticos profundos na síntese enzimática de ésteres de açúcar Resumo: O processo enzimático para a síntese de ésteres de açúcar, compostos de grandeinteresse industrial, apresenta várias vantagens. As enzimas são regiosseletivas, o quepermite a produção do produto desejado em uma única etapa de reação, algo que nãoocorre no processo químico convencional. Além disso, por ser um processo de síntese, areação deve ocorrer em meios reacionais não aquosos, tipicamente utilizando solventesorgânicos. No entanto, devido à toxicidade associada aos solventes orgânicos, foramproduzidos solventes ambientalmente amigáveis, como os solventes eutéticos profundos(DESs), que têm mostrado resultados promissores na síntese de ésteres. Neste trabalho,foi realizada a acetilação da D-glucose com acetato de vinila, em uma reação catalisadapela Lipase B de Candida antarctica (CALB) e pelo sólido fermentado contendo lipasesde Burkholderia contaminans LTEB11. O produto principal da reação foi o a-D-6-Oacetilglucopiranosídeo,que foi purificado por cromatografia flash, identificado por RMNe IR, e quantificado por HPLC. A síntese do produto de interesse foi conduzida em meiocontendo DESs, preparados a partir de uma mistura de cloreto de colina e glucose(ChCl:Glu 1:1) e cloreto de colina e glicerol (ChCl:Gli 1:2). Para fins de comparação, asíntese também foi realizada em um sistema livre de solvente, utilizando como substratometil-a-D-glucose em acetato de vinila puro. Os resultados mostraram que a síntese demetil-a-D-6-O-acetilglucopiranosídeo no sistema livre de solvente obteve umdesempenho de 82% de conversão, comparado com o sistema DES (ChCl:Glu), quealcançou 44% de conversão do éster de açúcar após 72 h de reação. A baixa conversão nosistema ChCl:Glu pode ser atribuída à alta viscosidade do DES. Com isso, foi avaliada aadição de diferentes concentrações de água (10%, 20% e 30% v v-1) como co-solventejunto ao ChCl:Glu. A mistura contendo 20% de água apresentou um maior resultado, com91% de conversão após 72 h de reação, comparado a conversão obtida no sistema semágua (44%). Porém, a concentração mais alta de água (30%) causou uma queda naconversão para 72%. Os resultados indicam que a adição de DES e água proporciona umambiente mais adequado para as reações enzimáticas, diminuindo a viscosidade do meioe melhorando a solvatação da enzima.; Abstract: The enzymatic process for the synthesis of sugar esters, compounds of great industrialinterest, presents several advantages. Enzymes are regioselective, allowing the productionof the desired product in a single reaction step, which does not occur in the conventionalchemical process. Additionally, since it is a synthesis process, the reaction must occur innon-aqueous reaction media, typically using organic solvents. However, due to thetoxicity associated with organic solvents, environmentally friendly solvents, such as deepeutectic solvents (DESs), have been developed and have shown promising results in thesynthesis of esters. In this work, the acetylation of D-glucose with vinyl acetate wascarried out in a reaction catalyzed by Lipase B from Candida antarctica (CALB) and bythe fermented solid containing lipases from Burkholderia contaminans LTEB11. Themain product of the reaction was a-D-6-O-acetylglucopyranoside, which was purified byflash chromatography, identified by NMR and IR, and quantified by HPLC. The synthesisof the product of interest was conducted in a medium containing DESs, prepared from amixture of choline chloride and glucose (ChCl:Glu 1:1) and choline chloride and glycerol(ChCl:Gli 1:2). For comparison purposes, the synthesis was also performed in a solventfreesystem, using methyl-a-D-glucose as a substrate in pure vinyl acetate. The resultsshowed that the synthesis of methyl-a-D-6-O-acetylglucopyranoside in the solvent-freesystem achieved a conversion of 82%, compared to the DES (ChCl:Glu) system, whichreached 44% conversion of the sugar ester after 72 h of reaction. The low conversion inthe ChCl:Glu system can be attributed to the high viscosity of the DES. Therefore, theaddition of different concentrations of water (10%, 20%, and 30% v v-1) as a co-solventalong with ChCl:Glu was evaluated. The mixture containing 20% water showed the bestresult, with 91% conversion after 72 h of reaction, compared to the conversion obtainedin the water-free system (44%). However, the highest water concentration (30%) causeda decrease in conversion to 72%. The results indicate that the addition of DES and waterprovides a more suitable environment for enzymatic reactions by reducing the viscosityof the medium and improving enzyme solvation. Orientadora: Profa. Dra. Nadia Krieger; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquimica. Defesa : Curitiba, 24/03/2025; Inclui referências Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/101901 2025-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/101812 A toxicidade dos derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos MI-J e MI-D em células HEPG2 está relacionada aos seus efeitos sobre a bioenergética mitocondrial Resumo: O carcinoma hepatocelular (CHC) é considerado um dos mais incidentes e representa a segunda causa de morte por câncer no mundo. Uma vez que poucas terapias são eficazes para esse tipo de câncer, é essencial a busca por novas opções de tratamento. Neste contexto, os derivados mesoiônicos 1,3,4-tiadiazóis são promissores por apresentarem atividade citotóxica e antitumoral contra diferentes linhagens de células tumorais. Neste estudo foram avaliados os efeitos dos derivados 1,3,4-tiadiazóis MI-J e MI-D em células de hepatocarcinoma humano (HepG2), cultivadas em dois meios de cultura, um com alta concentração de glucose (MEIO AG), para direcionar o metabolismo para a via glicolítica e, outro sem glucose e com glutamina e galactose (MEIO GAL), para favorecer a fosforilação oxidativa. Em meio AG, no tempo de 24h, pelo método do MTT a viabilidade foi reduzida em ~23% por ambos derivados na concentração de 25 µM. Pelo método do cristal violeta nessas mesmas condições, a redução foi mais pronunciada (~47%) aumentando a redução nos outros tempos avaliados (48h e 72h). Na maior concentração (50 µM), a redução foi de ~90% para ambos compostos nos dois métodos. Essa citotoxicidade, na concentração de 50 µM, foi confirmada pelo aumento da atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH), no meio de cultura, em ~90% após 24h de incubação. Em meio GAL, neste mesmo tempo de incubação, observou-se uma redução na viabilidade pelo método do MTT de ~57% para o MI-J e de ~20% para o MI-D, na menor concentração (5 µM), chegando a ~67% de redução para ambos os compostos na concentração de 50 µM. Pelo método do cristal violeta, na concentração de 5 µM, a citotoxicidade foi de ~19%, aumentando para ~49% na concentração intermediária (25 µM), com perfil semelhante para ambos os compostos em 24h. A enzima LDH apresentou maior atividade no tempo de 72h, com ~41% de aumento para o MI-J e ~36% para o MI-D, na concentração de 50 µM. Ensaios de respiração celular evidenciaram que o fluxo de oxigênio nas células HepG2 foi alterado com o aumento da concentração dos derivados, sendo estes efeitos mais pronunciados no meio GAL. Foi observada a diminuição nos níveis de ATP (~38%) na concentração de 25 µM do MI-J em meio GAL, enquanto que, em meio AG a redução observada para esse composto foi menos pronunciada (~27%). Nessa mesma concentração, o MI-D reduziu os níveis de ATP apenas em meio GAL (~15%). Em meio AG, ambos os compostos promoveram um aumento de ~32% nos níveis de lactato na concentração de 25 µM. Nessa concentração em meio GAL, os níveis de lactato aumentaram cerca de ~46% com o MI-J e ~35% com o MI-D. No mesmo meio, os níveis de piruvato diminuíram em ~15% após a exposição ao MI-J e ~ 9% com o MI-D. Em conjunto, estes resultados confirmam a toxicidade dos derivados MI-J e MI-D para as células HepG2. Também sugerem que o comprometimento de funções mitocondriais está relacionado à toxicidade dos derivados nestas células, uma vez que foram mais pronunciados em meio contendo galactose e glutamina.; Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) is considered the most prevalent liver cancer and represents the second cause of cancer death worldwide. Since few therapies are effective for this type of cancer, the research for new treatments is essential. In this context, mesoionic derivatives from 1,3,4-thiadiazolium class are promising due to their cytotoxic and antitumor activities against different tumor cells. This study evaluated the effects of 1,3,4-thiadiazoles derivatives MI-J and MI-D on human hepatocarcinoma cells (HepG2). Two culture media were used, the first one containing glucose at high concentration (AG medium), with the aim of directing the metabolism to glycolic pathway and the other not containing glucose and supplemented with glutamine and galactose (GAL medium), to favoring the oxidative phosphorylation. In AG medium, MTT method showed a reduction of ~ 23%, for both derivatives, MI-J and MI-D (25 M). At the same conditions, crystal violet method also evidenced a reduction in the cells viability; however, it was more pronounced (at ~ 47%, 48h and 72h of incubation). At the highest concentration (50 µM), the derivatives reduced the viability around 90%, as showed by MTT and crystal violet methods. This cytotoxicity was confirmed by the increased activity of Lactate Dehydrogenase (LDH) for both culture media (~ 90%, 24h of incubation). In the GAL medium, the viability was reduced at ~ 57% and ~ 20%, for MI-J and MI-D (5 µM), respectively, as observed by MTT method, after 24h of incubation. This reduction reached to ~ 67% for both compounds at the concentration of 50 µM. When the method was crystal violet staining, the cytotoxicity of both derivatives was similar (~19%) at the lowest concentration (5 µM), increasing to ~ 49% at the intermediate concentration (25 µM). The LDH activity was increased after 72 h of incubation with the derivatives, by around 41% and 36%, for MI-J and MI-D (50 µM), respectively. The assays of cellular respiration in AG medium showed that the derivatives promoted a decrease in oxygen flux of HepG2 cells, in a concentration dependent way. The cellular respiration was changed by both derivatives in a concentration dependent way, being this effect more pronounced in GAL medium. ATP levels decreased (~38%) in response to incubation with MI-J (25 µM) after 24h of incubation in the GAL medium. In AG medium, this reduction was less pronounced (~27%). MID (25 µM) reduced the ATP levels only in GAL medium (~15%). In AG medium, both derivatives (25 µM) promoted an increase of ~ 32% in lactate levels, while in GAL medium the metabolite was increased about ~ 46% and 35% for MI-J and MI-D, respectively. In the same medium, pyruvate levels decreased at ~ 15% and 9% after 24h of exposure to MI-J and MI-D, respectively. Taken together, these results reinforce the toxicity of MI-J and MI-D on HepG2. The results also suggest that the impairment of mitochondrial functions is related to the toxicity of the derivatives in HepG2 cells, since their effects were more pronounced when these cells were cultured in medium supplemented with galactose and glutamine in the absence of glucose. Orientadora: Dra. Silvia Maria Suter Correia Cadena; Coorientador: Dra. Amanda do Rocio Andrade Pires; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 28/03/2018; Inclui referências: p.76-85 Mon, 01 Jan 2018 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/101812 2018-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/98636 Caracterização da enzima N-acetil-L-glutamatoquinase (NAGK) e sua possível interação com as proteínas PII (GlnZ e GlnB) em Azospirillum brasilense Resumo: A alfa-proteobactéria Azospirillum brasilense é amplamente estudada e possui relevância econômica devido à sua capacidade de promover o crescimento vegetal por meio da fixação biológica de nitrogênio e da produção de fitormônios. Entre as vias envolvidas no destino do nitrogênio fixado, destaca-se a biossíntese de arginina, na qual a N-acetil-L-glutamato quinase (NAGK) catalisa uma etapa regulatória a partir do glutamato em organismos que realizam o ciclo de síntese de ornitina. A arginina é um aminoácido-chave como fonte de nitrogênio, atuando como precursora de poliaminas em A. brasilense e da ureia, compostos que podem ser transferidos à planta hospedeira durante a associação. Em microrganismos, a NAGK pode apresentar duas formas estruturais: dimérica, insensível à arginina (como em E. coli), e hexamérica, sensível à arginina (como em cianobactérias). Nessa última, a regulação é mediada por proteínas PII, reguladoras e transdutoras de sinal, interação que não ocorre em E. coli. Em A. brasilense, entretanto, não há dados consolidados sobre a interação entre as PII (GlnB e GlnZ) e a NAGK hexamérica. Considerando a relevância dessa via, o presente trabalho buscou caracterizar a NAGK de A. brasilense (AbNAGK) quanto à atividade enzimática, estrutura e interação com as proteínas PII GlnZ e GlnB, além de avaliar a influência de metabólitos e modificações estruturais sobre sua função. Para atingir esses objetivos, a proteína foi purificada com cauda de histidina e também em sua forma nativa, a partir de vetores de produzidos em E. coli. As proteínas NAGK e PII foram purificadas por cromatografia de afinidade ou troca iônica com subsequente remoção de caudas de histidina quando aplicável. Foram realizados ensaios de interação proteína-proteína (pull-down) fotometria de massas, cinética enzimática e cromatografia por exclusão de tamanho para elucidar o estado oligomérico e possíveis complexos formados. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos de efetores como ATP e 2-oxoglutarato, bem como a sensibilidade à arginina. Os resultados sugerem que a presença da cauda de histidina na porção N-terminal de AbNAGK influencia sua oligomerização, favorecendo a formação de dímeros e alterando a sensibilidade à arginina, em contraste com a enzima nativa que mantém o estado hexamérico típico. As proteínas PII interagem com AbNAGK nativa de forma dependente de efetores, sugerindo um mecanismo de regulação fino em resposta ao estado nitrogenado celular. A análise cinética de NAGK-his indicou valores de Km e kcat acima dos reportados para NAGKs bacterianas, indicando mal funcionamento da enzima nas condições testadas. Desse modo, a partir dos resultados observados, conclui-se que a AbNAGK precisa de sua região N terminal livre para adotar a conformação hexamérica, condição necessária para a interação com as proteínas PII, observadas aqui na presença do efetor ATP, e para a função catalítica da enzima; Abstract: The alpha-proteobacterium Azospirillum brasilense is widely studied and has economic relevance due to its ability to promote plant growth through biological nitrogen fixation and the production of phytohormones. Among the pathways involved in the fate of fixed nitrogen, arginine biosynthesis stands out, in which N-acetyl-L-glutamate kinase (NAGK) catalyzes a regulatory step from glutamate in organisms that perform the ornithine synthesis cycle. Arginine is a key amino acid as a nitrogen source, acting as a precursor of polyamines in A. brasilense and of urea, compounds that can be transferred to the host plant during the association. In microorganisms, NAGK can occur in two structural forms: dimeric, insensitive to arginine (as in E. coli), and hexameric, arginine-sensitive (as in cyanobacteria). In the latter, regulation is mediated by PII proteins, regulatory and signal-transducing proteins, an interaction that does not occur in E. coli. In A. brasilense, however, there are no consolidated data on the interaction between PII proteins (GlnB and GlnZ) and the hexameric NAGK. Considering the relevance of this pathway, the present work aimed to characterize A. brasilense NAGK (AbNAGK) in terms of enzymatic activity, structure, and interaction with the PII proteins GlnZ and GlnB, as well as to evaluate the influence of metabolites and structural modifications on its function. To achieve these objectives, the protein was purified with a histidine tag and also in its native form, from vectors expressed in E. coli. NAGK and PII proteins were purified by affinity or ion-exchange chromatography with subsequent removal of histidine tags when applicable. Protein–protein interaction assays (pull-down), mass spectrometry, enzyme kinetics, and size-exclusion chromatography were performed to elucidate the oligomeric state and possible complexes formed. In addition, the effects of effectors such as ATP and 2-oxoglutarate were evaluated, as well as arginine sensitivity. The results suggest that the presence of the histidine tag at the N-terminal region of AbNAGK influences its oligomerization, favoring dimer formation and altering arginine sensitivity, in contrast to the native enzyme, which maintains the typical hexameric state. The PII proteins interact with native AbNAGK in an effector-dependent manner, suggesting a fine regulatory mechanism in response to the cellular nitrogen status. Kinetic analysis of His-tagged NAGK indicated Km and kcat values higher than those reported for bacterial NAGKs, pointing to malfunctioning of the enzyme under the tested conditions. Thus, based on the observed results, it can be concluded that AbNAGK requires a free N-terminal region to adopt the hexameric conformation, a condition necessary for interaction with PII proteins observed here in the presence of the effector ATP and for the catalytic function of the enzyme Orientador: Profª. Drª. Edileusa Cristina Marques Gerhardt; Banca: Edileusa Cristina Marques Gerhardt (Presidente da Banca), Luciano Fernandes Huergo e Ana Claudia Bonatto; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 22/08/2025; Inclui referências Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/98636 2025-01-01T00:00:00Z