https://hdl.handle.net/1884/39612 Sat, 25 Apr 2026 12:10:42 GMT 2026-04-25T12:10:42Z https://hdl.handle.net/1884/98445 Metabolismo energético de carboidratos e de proteínas em Astyanax lacustris submetidos a estresse térmico agudo Resumo: Organismos aquáticos, em especial que habitam rios e pequenos afluentes de águas, estão mais expostos a variações térmicas se comparados a grandes porções hidrográficas, afetando mais facilmente a ictinofauna presente. Como organismos ectotérmicos, a temperatura é o principal fator abiótico que interfere no desenvolvimento de peixes, e mudanças que extrapolam a faixa de temperatura adequada à espécie levam a uma condição de estresse térmico implicando mudanças no equilíbrio de suas atividades bioquímicas, moleculares e fisiológicas. Neste contexto, o estresse térmico sofrido por peixes e sua consequente perda da homeostase, tem repercussão desde a capacidade de ingestão de alimentos até os processos digestivos, a eficiência na absorção de nutrientes e ao estoque do excedente de energia. Com o objetivo de avaliar como uma condição de choque térmico agudo em alta temperatura afeta o metabolismo de carboidratos e proteínas em Astyanax lacustris, o presente trabalho fez uso de método espectrofotométrico para inferir a atividade enzimática de 8 biomarcadores (hexoquinase, lactato desidrogenase, malato desidrogenase, glicose-6-fosfato desidrogenase, citrato sintase, aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase, glutamato desidrogenase) do metabolismo energético, amostrados no encéfalo, fígado, músculo e brânquias desse peixe, em 5 tempos de exposição ao estresse térmico ( 2, 6, 12, 24 e 48 horas). O Encéfalo apresentou um aumento da atividade enzimática em todos os biomarcadores analisados, com exceção de alanina aminotransferase, em um primeiro momento. O órgão que teve maior prejuízo em sua atividade metabólica em relação aos respectivos controles foram as brânquias, possivelmente por estar mais exposta ao meio externo e a desnaturalização proteica. Enzimas como lactato desidrogenase e glutamato desidrogenase apresentaram aumento em sua atividade em todos os tempos analisados no fígado quando comparadas aos seus controles em temperatura de aclimatação. Dentre as inúmeras metodologias de inferência da atividade enzimática as baseadas em espectrofotometria são amplamente utilizadas. Baseado nisso este trabalho propôs uma metodologia de otimização do cálculo da atividade enzimática de dados provenientes da leitura de microplacas pelo espectrofotômetro, baseado na seleção do grupo ótimo de leituras respeitando as restrições metodológicas da literatura através do use de sliding window. Foi encontrado diferenças significativas entre o algoritmo proposto e os cálculos manuais para determinação da porção linear da curva de absorbância, no slope resultante e consequentemente na atividade enzimática para as amostras analisadas; Abstract: Aquatic organisms, particularly those inhabiting rivers and small water tributaries, are more exposed to thermal fluctuations compared to those in larger hydrographic systems, which more readily affects the local ichthyofauna. As ectothermic organisms, temperature is the main abiotic factor influencing fish development, and deviations beyond the optimal thermal range for a given species result in thermal stress, leading to disturbances in the balance of their biochemical, molecular, and physiological processes. In this context, thermal stress experienced by fish and the consequent loss of homeostasis can impact a wide range of biological functions, from food intake and digestion to nutrient absorption efficiency and energy storage. With the aim of evaluating how acute high-temperature thermal shock affects carbohydrate and protein metabolism in Astyanax lacustris, this study employed a spectrophotometric method to infer the enzymatic activity of eight biomarkers (hexokinase, lactate dehydrogenase, malate dehydrogenase, glucose-6 phosphate dehydrogenase, citrate synthase, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, and glutamate dehydrogenase) related to energy metabolism. These were assessed in the brain, liver, muscle, and gills of the fish at five different thermal stress exposure durations (2, 6, 12, 24, and 48 hours). The brain exhibited increased enzymatic activity across all analyzed biomarkers, except for alanine aminotransferase, at the initial stages. The gills showed the most significant impairment in metabolic activity compared to the respective control groups, likely due to their greater exposure to the external environment and consequent protein denaturation. Enzymes such as lactate dehydrogenase and glutamate dehydrogenase exhibited increased activity at all time points in the liver when compared to the control groups maintained at acclimation temperature. Among the various methods for inferring enzymatic activity, spectrophotometric approaches are widely used. Based on this, the present study proposed an optimization methodology for calculating enzymatic activity from microplate readings obtained via spectrophotometry. This method was based on the selection of the optimal set of readings, adhering to methodological constraints reported in the literature, through the use of a sliding window approach. Significant differences were observed between the proposed algorithm and manual calculations in determining the linear portion of the absorbance curve, the resulting slope, and consequently the enzymatic activity of the analyzed samples Orientadora: Profª Drª Lucélia Donatti; Banca: Lucélia Donatti (Presidente da Banca), Katya Naliwaiko e Anselmo Chaves Neto; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 01/07/2025; Inclui referências; Área de concentração: Biologia Celular e Molecular Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/98445 2025-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100977 Obtenção, caracterização e validação de biomoléculas como ferramentas para detecção de desreguladores endócrinos e metais tóxicos em Danio rerio Resumo: Testes baseados em imunoensaios aparecem como técnicas promissoras para avaliação da qualidade da água. Ao nível de expressão das proteínas, a Vitelogenina (VTG) e a Metalotioneína (MT) podem ser usadas como imunosensores para detectar poluentes desreguladores endócrinos estrogênicos e metais tóxicos, respectivamente. O atual estudo busca obter, caracterizar e validar as proteínas nativas VTG e MT do organismo modelo D. rerio e seus respectivos anticorpos específicos. As proteínas nativas foram obtidas por meio da exposição hídrica de exemplares machos e fêmeas aos contaminantes 17a-etinilestradiol (EE2) e cloreto de cádmio (CdCl2) e purificadas por cromatografia líquida. Dentre as estratégias para obter a VTG, a Cromatografia por Troca Iônica (CTI) foi a mais eficiente, pois apresentou maior rendimento e melhor grau de pureza entre as cromatografias testadas. Por sofrer degradação devido a condições desnaturantes, a VTG apresenta um padrão multibanda nas análises de SDS-PAGE e western blot. A proteína, que normalmente possui peso molecular próximo a 130 kDa, apresentou vários domínios com pesos moleculares menores, devido ao processo de fragmentação. A CTI também apresentou ser mais eficiente para purificar a MT, visto que foi possível isolar o que parece ser seus dímeros (isoforma I e II) e oligômero (peso molecular ~150 kDa). Como a MT tem alta propensão em formar agregados, que variam de ~14 kDa até ~150 kDa, também é possível observar o padrão multibandas nas análises de SDS-PAGE e western blot. Em seguida, as proteínas purificadas foram adsorvidas em colunas cromatográficas para imunopurificação de anticorpos IgG específicos, provenientes do soro de coelhos. Os anticorpos purificados foram avaliados por SDS-PAGE, biotinilados e validados frente aos extratos proteicos de D. rerio nos ensaios de ELISA e western blot. As tentativas para purificar a IgG foram mal sucedida devida à baixa afinidade e rendimento dos anticorpos. Não foi possível diferenciar a concentração das proteínas do extrato total entre machos e fêmeas por meio do anti- VTG no ELISA e, pelo western blot, se verificou que o anticorpo apresenta reação cruzada com uma proteína de baixo peso molecular (~40 kDa), presente em ambos os sexos. Já o anti-MT apresentou padrão de afinidade baixo diante da MT purificada e do extrato total. Assim, como alternativa, foi realizada a purificação dos anticorpos IgY da gema do ovo de galinhas. Foi possível separar as proteínas solúveis da gema pelo protocolo de extração, sendo que a Cromatografia por Troca Iônica, seguida por Interação Hidrofóbica, conseguem purificar a IgY com alto grau de pureza. Os resultados com a VTG e MT mostram que ainda são necessários ensaios para verificar a estabilidade físico-químico dessas proteínas, visando compreender o perfil que elas apresentam sob condições de pH, aquecimento, congelamento/descongelamento e presença de agentes redutores. Como alternativa, os anticorpos obtidos a partir da gema do ovo poderia ser uma alternativa viável para identificar essas proteínas no ELISA e western blot; Abstract: Tests based on immunoassays appear as promising techniques for water quality assessment. At the level of protein expression, Vitellogenin (VTG) and Metallothionein (MT) can be used as immunosensors to detect estrogenic endocrine-disrupting pollutants and toxic metals, respectively. The current study seeks to obtain, characterize and validate the native proteins VTG and MT of the model organism D. rerio and their respective specific antibodies. The native proteins were obtained through the water exposure of male and female specimens to the contaminants 17a-ethinylestradiol (EE2) and cadmium chloride (CdCl2) and purified by liquid chromatography. Among the strategies to obtain the VTG, the Ionic Exchange Chromatography (IEX) was the most efficient, as it presented the highest yield and the best degree of purity among the chromatographies tested. As it undergoes degradation due to denaturing conditions, VTG presents a multiband pattern in SDS-PAGE and western blot analyzes. The protein, which normally has a molecular weight close to 130 kDa, has several domains with lower molecular weights, due to the fragmentation process. CTI also proved to be more efficient to purify MT, since it was possible to isolate what appears to be its dimers (isoforms I and II) and oligomer (molecular weight ~150 kDa). As MT has a high propensity to form aggregates, ranging from ~14 kDa to ~150 kDa, it is also possible to observe the multiband pattern in SDS-PAGE and western blot analyses. Then, the purified proteins were adsorbed on chromatographic columns for immunopurification of specific IgG antibodies from rabbit serum. The purified antibodies were evaluated by SDS-PAGE, biotinylated and validated against D. rerio protein extracts in ELISA and western blot assays. Attempts to purify the IgG were unsuccessful due to the low affinity and yield of the antibodies. The anti-VTG did not differentiate the concentration of the protein of the total extract between males and females in the ELISA and, by the western blot, it was verified that the antibody presents a cross reaction with a low molecular weight protein (~40 kDa), present in both the sexes. On the other hand, anti-MT showed a low affinity pattern compared to purified MT and total extract. Thus, as an alternative, the purification of lgY antibodies was carried out from the egg yolk of chicken. It was possible to separate the soluble proteins from the yolk by the extraction protocol, and the Ionic Exchange Chromatography, followed by Hydrophobic Interaction, manage to purify the lgy, with a high degree of purity. The results with VTG and MT show that tests are still needed to verify the physicochemical stability of these proteins, in order to understand the profile they present under pH, heating, freezing/thawing conditions and the presence of reducing agents. Alternatively, antibodies obtained from egg yolk could be a viable alternative to identify these proteins in ELISA and western blot Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Ferreira Randi; Coorientador: Dr. Claudemir de Souza; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 04/08/2022; Inclui referências; Área de concentração: Biologia Celular e Molecular Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/100977 2022-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100249 Estudo do mecanismo de recrutamento de mastocitos para sitios perifericos Resumo: Os grànuios citoplasmáticos dos mastócitos contêm inúmeras substâncias que, quando liberadas, participam das respostas alérgicas e inflamatórias. A liberação de tais substâncias está relacionada com o estímulo dos mastócitos, que ocorre quando os receptores de alta afinidade (FC sR I) para imunoglobulina E (IgE) são interligados ou, também, de maneira independente dos FCeRI, através da ação de substâncias como o composto 48/80, que causa a desgranuiação dos mastócitos de forma não-citotóxica. A lise dos mastócitos pela água destilada causa a liberação apenas dos mediadores pré- formados contidos nos grânulos dos mastócitos, tais como a histamina, a heparina, o fator quimiotático para eosinófilos na anafilaxia (EC F-A ) e proteases. A desgranuiação causada pela anti-IgE ou pelo composto 48/80, além destes fatores, também libera os mediadores neo-formados, como os leucotrienos, prostaglandinas e citocinas. O s m ecanism os de diferenciação e crescimento dos mastócitos e de seus precursores são determinados pela ação de fatores de crescimento e outras interleucinas, porém, não se conhece exatamente quais os fatores que estão envolvidos no recrutamento dos mastócitos da medula óssea. Para investigar se os mediadores químicos pré-formados e neo-formados liberados pelos mastócitos participam do processo de recrutamento destas células da medula óssea, ratos foram injetados intraperitonealmente com água destilada, que causa lise dos mastócitos, com anti-IgE e com o composto 48/80, que causam a desgranuiação dos mastócitos de forma dose-dependente. O s mastócitos da medula ó ssea foram isolados com esferas magnéticas conjugadas ao mAb BGD6, específico para mastócitos. A população de mastócitos da medula ó ssea obtida de animais controle varia entre 2,38% e 2,5%. A diminuição da população de mastócitos da medula ó ssea observada 48 horas após a injeção intraperitoneal de água destilada, anti-IgE e composto 48/80, ocorre de maneira equivalente nos três tratamentos: 0,6%; 0,75% e 0,41%, respectivamente. Animais também foram injetados com o fator estimulador de colônias de granulócito (G -C S F) e o fator estimulador de colônias de granulócito/macrófago (G M -CSF), os quais não provocaram desgranuiação dos mastócitos peritoneais e não promoveram redução na população de mastócitos da medula óssea. O G -C S F promoveu um aumento da população de mastócitos da medula ó ssea (5,48%) e induziu o aparecimento de mastócitos imaturos no mesentério. O G M -C SF não alterou a população de mastócitos da medula óssea, que manteve o mesmo número de células encontrado nos controles. O s resultados sugerem que os compostos pré-formados liberados pelos mastócitos são suficientes para recrutar estas células e seus precursores da medula óssea; Summary: Mast celi cytoplasmic granules contain numerous substances íhat when released participate in ailergic and inflammatory responses. Mast cell granuies may be released when the mast cells are activated by cross-linking of the high affinity IgE receptor (FCsRI), or in an FCeRI independent manner by substances such as Compound 48/80 that cause the non-cytoxic degranulation of mast cells. The lysis of mast cells by distilled water results in the release of only the preformed mediators such as histamine, heparin, chemotactic factor for eosinophils in anaphalaxis (EC F-A ) and proteases. W hen mast cells are degranulated by anti-IgE or by Compound 48/80, in addition to releasing the pre-formed factors, the cells also release newly formed mediators such as leukotrienes, prostaglandins and cytokines. Although the growth and differentiation of mast cells and their precursors are controlled by the action of growth factors and other interleukines, it is not know exactly which factors are involved in the recruitment of mast cells from the bone marrow to peripheral sites. In order to investigate whether the pre-formed or newly formed mediators released by mast cells play a role in the recruitment of mast cells from the bone marrow, rats were injected mtraperitoneally with distilled water which lyses the mast cells or with anti-IgE or with Compound 48/80 both of which degranulate the mast cells in a dose dependent fashion. Mast cells were isolated from the bone marrow by immunomagnetic isolation using magnetic beads conjugated with the mast cell specific antibody mAb BGD6. In control animais, between 2.38% and 2.5% of the cells in the bone marrow were mast cells. Intraperitoneal injection with distilled water, anti-IgE or Compound 48/80, ali resulted in a similar diminution (0.6%; 0.75% and 0.41% ) of mast cells in the bone marrow. Animais were also injected with two growth factors, granulocyte colony-stimulating factor (G -C S F) and granulocyte/macrophage-colony stimulating factor (G M -CSF) that do not stimulate mast cell degranulation. No reduction in the number of mast cells in the bone marrow w as observed with either factor. However, intraperitoneal exposure to G -C S F cau ses an increase in the number of mast cells in the bone marrow (5.48% ) and increased the number of immature mast cells in the mesentery. After exposure to G M -C SF, the number of mast cells seen in the bone marrow and in the mesentery was the sam e as that seen in control animais. Our results suggest that the pre-formed mediators released by mast cells are sufficient to recruit mast cells and their precursors from the bone marrow Orientadora: Maria Celia Jamur; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Parana, Setor de Ciencias Biologicas Sat, 01 Jan 2000 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/100249 2000-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100241 Influência da ADAM23 recombinante na distribuição de GFP-PRPC na membrana de células das linhagens N2a e HEK293T Resumo: A PrPc é uma glicoproteína ancorada em GPI presente em quase todos os tipos celulares e residente dos microdomínios de membrana (lipid rafts). Embora sua expressão seja acentuada no sistema nervoso, onde estabelece interações com parceiros moleculares, executa funções de modulação de toxicidade, modulação sináptica, interferências em vias de sinalização e, em eventos patológicos, está associada à encefalopatias espongiformes transmissíveis. Entre seus parceiros está a ADAM23, uma desintegrina e metaloprotease não catalítica de múltiplos domínios, com expressão quase restrita às células nervosas, durante o período embrionário e na fase adulta. Apesar de não ser residente dos lipid rafts, sua forma madura pode transitar nesses microdomínios de membrana. Assim como a PrPc , a ADAM23 possui relevância para o desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso, principalmente pelo potencial de participar na adesão celular e plasticidade sináptica. Diante disso, com o estabelecimento da interação direta entre as duas proteínas e sua co-localização, o presente trabalho buscou investigar a influência da ADAM23 recombinante no deslocamento da GFP-PrPc na membrana de duas linhagens celulares (HEK293T e N2a). Para isso, foi realizada, satisfatoriamente, a purificação da ADAM23 (dis+cys), proteína com marcação 6HIS que possui dois domínios isolados da ADAM23: desintegrina (responsável pela interação com PrPc ) e domínio rico em cisteína (reconhecido pelo anticorpo DL11C8). Esta foi utilizada como ligante, diretamente no meio de cultura, em células expressando GFP-PrPc . Para avaliar o deslocamento nos lipid rafts, foi usada a ultracentrifugação em um gradiente de concentração de Nycodenz. Além disso, visando estabelecer a cinética de internalização, foi utilizada a biotinilação de superfície e posterior purificação dos extratos celulares com Avidina-Agarose. Como metodologia comparativa de interação, foi realizada a co-expressão de GFP-PrPc e ADAM23-Myc-Flag, no mesmo sistema. Nos ensaios de deslocamento com a HEK293T foram verificados padrões indesejados no processamento da GFP-PrPc , o que restringiu as análises ao modelo celular N2a, sendo esta mais promissora no contexto atual. Embora não tenha sido possível realizar ensaios conclusivos acerca da influência da ADAM23 recombinante na endocitose da GFP-PrPc , os resultados do deslocamento revelaram variação na presença da GFP-PrPc na membrana a depender da estratégia metodológica utilizada. Com a co-expressão, a GFP-PrPc foi identificada com mais presença em regiões rafts, indicando possível retenção nesses microdomínios. O oposto ocorreu nos ensaios utilizando o ligante purificado, em que a GFP-PrPc foi deslocada para regiões não rafts. Embora sejam dados parciais, esses resultados podem revelar a complexidade biológica existente na interação ADAM23-PrPc e sugerir diferentes abordagens para explorar a função biológica dessa interação; Abstract: The PrPc is a GPI-anchored glycoprotein present in almost all cell types and residing in membrane microdomains (lipid rafts). Although its expression is particularly prominent in the nervous system, where it interacts with molecular partners, is involved in toxicity modulation, synaptic regulation, signaling pathways, and, under pathological conditions, is associated with transmissible spongiform encephalopathies. Among its partners is ADAM23, a desintegrin and metalloprotease non-catalytic with expression largely restricted to neuronal cells during both embryonic development and adulthood. Although not a resident of lipid rafts, its mature form can traffic through these membrane microdomains. Like PrPc , ADAM23 plays an important role in nervous system development and maintenance, mainly due to its potential participation in cell adhesion. Given the direct interaction and co-localization previously established between these two proteins, the present study aimed to investigate the influence of recombinant ADAM23 on the distribution of GFP-PrPc in the membrane of two cell lines (HEK293T and N2a). For this purpose, ADAM23 (dis+cys) was successfully purified. This protein, tagged with 6HIS, contains two isolated domains of the full-length ADAM23: the disintegrin domain (responsible for interaction with PrPc ) and the cysteine-rich domain (recognized by the DL11C8 antibody). It was used as a ligand directly in the culture medium of GFP-PrPc–expressing cells. To assess displacement within lipid rafts, ultracentrifugation in a Nycodenz gradient was performed. Additionally, to evaluate internalization kinetics, surface biotinylation followed by purification of cell extracts with Avidin-Agarose was carried out. As a comparative interaction strategy, co-expression of GFP-PrPc and ADAM23-Myc-Flag in the same system was also employed. In displacement assays with HEK293T, undesirable processing patterns of GFP-PrPc were observed, restricting the analyses to the N2a cell model, which proved more suitable in the current context. Although conclusive results regarding the effect of recombinant ADAM23 on GFP-PrPc endocytosis could not be obtained, displacement assays revealed variations in GFP-PrPc distribution depending on the methodological approach. Under co-expression, GFP-PrPc showed greater enrichment in lipid rafts, suggesting possible retention in these microdomains. In contrast, incubation with the purified ligand led to its displacement toward non-raft regions. Although partial, these findings highlight the biological complexity of the ADAM23–PrPc interaction and suggest different approaches to further explore the biological significance of this interplay Orientador: Prof. Dr. Silvio Marques Zanata; Banca: Silvio Marques Zanata (Presidente da Banca), Michele Dietrich Moura Costa, Marcia Helena Appel; Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 29/09/2026; Inclui referências Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT https://hdl.handle.net/1884/100241 2025-01-01T00:00:00Z