https://hdl.handle.net/1884/65683 2026-04-04T08:47:55Z https://hdl.handle.net/1884/95070 Avaliação genética de possíveis casos de deficiência de descarboxilases de aminoácidos aromáticos em pacientes com atraso do neurodesenvolvimento e transtornos motores Resumo: A paralisia cerebral (PC) é causada por lesões neuronais de origem gestacional, obstétrica ou perinatal. Estas lesões podem ser desencadeadas por hipóxia, hipoglicemia, traumatismo, hemorragia, infecções, exposição a substâncias químicas e alterações genéticas como a deficiência da descarboxilase de aminoácidos aromáticos (AADCD, do inglês Aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency). A AADCD é uma doença rara, com padrão autossômico recessivo e com mais de 580 variantes genéticas já descritas. As principais manifestações clínicas da AADCD são crises oculogíricas, hipotonia, alterações autonômicas, distúrbios do neurodesenvolvimento e transtornos motores (DNTM). O diagnóstico da AADCD, normalmente clínico, pode ser confirmado por exames bioquímicos e genéticos. Análises genéticas realizadas por sequenciamento de nova geração (NGS, do inglês Next Generation Sequencing) permitem identificar novas variantes gênicas. Em relação ao tratamento da AADCD, os fármacos disponíveis apresentam eficácia limitada aos casos leves. Entretanto, terapia gênica recentemente desenvolvida e aprovada no Brasil (eladocageno exuparvoveque) demonstram resultados promissores incluindo os quadros clínicos moderados e graves. Diante disso, esse estudo teve como objetivo determinar possíveis casos de DDC bem como caracterizar o perfil sociodemográfico e clínico de pacientes com PC/DNTM. A partir de células da mucosa bucal, foi realizado painel genético (121 genes), por meio de NGS, em 44 pacientes com DNTM atendidos por uma Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais localizada em município da região Oeste do Paraná, Brasil. Os resultados, descritos de forma quantitativa, foram analisados pelo teste do qui Quadrado (p<0,05*) para avaliar a associação entre as variáveis categóricas e suas respectivas frequências observadas e esperadas. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Paraná (parecer nº 6.568.371 e C.A.A.E. 74574323.1.0000.0102). Painel genético apresentou resultado ausente para DDC em todos os pacientes. Contudo, um participante apresentou alteração genética em heterozigose não relacionada a DDC e considerada de significado clínico incerto (gechr6:161.973.300-166.167.591, CNV-deleção de 4.2 Mb em 6q26q27). Amostra caracterizada por participantes predominantemente do sexo masculino (59,1%), com idade inferior a 18 anos (52,3%), renda familiar per capita de 1 salário mínimo (59,3%) e autodeclarada branca (65,9%). Mediana da idade foi de 12 anos. Identificou-se 6,7% de casamentos consanguíneos. Frequência de genitores com idade avançada (maior que 40 anos) no nascimento foi menor (p=0,002*) que a observada na população. Já o histórico familiar de atraso do neurodesenvolvimento (p<0,0001*), idade materna de risco para cromossomopatias (p=0,019*), histórico de complicações gestacionais (p<0,0001*) e nascimento prematuro (p=0,002*) tiveram frequências maiores que o esperado. Parto cesáreo foi relatado em 44,8% dos casos. Exposição e/ou consumo de álcool, tabaco e outras drogas na gestação foi de 8%. Necessidade de fototerapia, registro de Apgar inferior a 7 no 1º e no 5º minutos e tempo de permanência na maternidade superior a 5 dias foram registrados em 37,5%, 20% e 50% dos pacientes, respectivamente. A prevalência de atraso em alguma fase do neurodesenvolvimento motor variou de 81,5% (idade em que sentou sozinho/não sentou) a 96,2% (idade em que andou/não andou). Apesar da ausência de DDC, revisão bibliográfica realizada aponta que os testes genéticos, diferentemente do recomendado atualmente, devem ser aplicados em qualquer idade e quadro clínico de DNTM; Abstract: Neuronal injuries of gestational, obstetric or perinatal origin cause the Cerebral Palsy (CP). Hypoxia, hypoglycemia, trauma, hemorrhage, infections, exposure to chemical substances and genetic changes, such as aromatic amino acid decarboxylase deficiency (AADCD), triggered the neuronal injuries. AADCD is a rare disease, with an autosomal recessive pattern and with more than 580 genetic variants already described. The main clinical manifestations of AADCD are oculogyric crises, hypotonia, autonomic changes, neurodevelopmental disorders and motor disorders (NDTM). The diagnosis of AADCD, normally clinical confirmed by biochemical and genetic tests. Genetic analyzes carried out by next generation sequencing (NGS) make it possible to identify new gene variants. Regarding the treatment of AADCD, the available drugs have limited effectiveness in mild cases. However, gene therapy recently developed and approved in Brazil (eladocageno exuparvoveque) demonstrates promising results including moderate and severe clinical conditions. The objective of this research was to determine possible cases of AADCD as well as characterize the sociodemographic and clinical profile of patients with CP/NDTM. Using cells from the oral mucosa, a genetic panel (121 genes) carried out, using NGS, in 44 patients with NDTM cared for by an Association of Parents and Friends of Disabled People located in a municipality in the western region of Paraná, Brazil. The results, described quantitatively, were analyzed using the chi-square test (p<0.05*) to evaluate the association between the categorical variables and their respective observed and expected frequencies. The Research Ethics Committee of the Federal University of Paraná (approval opinion n º 6.568.371 and C.A.A.E. 74574323.1.0000.0102) approved this research. Genetic panel showed missing results to AADC gene for all patients. However, one participant presented heterozygous genetic alteration unrelated to AADCD and considered of uncertain clinical significance (gechr6:161,973,300-166,167,591, CNV-deletion of 4.2 Mb in 6q26q27). Sample characterized by predominantly male participants (59.1%), under the age of 18 (52.3%), per capita family income of one minimum wage (59.3%) and self-declared white (65.9%). Median age was 12 years. Identified 6.7% of consanguineous marriages. The frequency of parents with advanced age (over 40 years old) at birth was lower (p=0.002*) than that observed in the population. Family history of neurodevelopmental delay (p<0.0001*), maternal age at risk for chromosomal defects (p=0.019*), history of gestational complications (p<0.0001*) and premature birth (p=0.002*) had higher frequencies than expected. The 44.8% of cases reported cesarean delivery. Exposure and/or consumption of alcohol, tobacco and other drugs during pregnancy was 8%. The 37.5%, 20% and 50% of patients, respectively, reported need for phototherapy, Apgar score of less than 7 in the 1st and 5th minutes and length of stay in the maternity ward of more than 5 days. The prevalence of delay in some phase of motor neurodevelopment ranged from 81.5% (age at which he sat alone/did not sit) to 96.2% (age at which he walked/did not walk). Despite the absence of AADCD, a bibliographic review carried out indicates that genetic tests, currently not recommended, should applied at any age and clinical condition of NDTM Orientador: Prof. Dr. Edivan Rodrigo de Paula Ramos; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Bioquímica e Biologia Molecular. Defesa : Palotina, 11/12/2024; Inclui referências 2024-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/93921 Aplicação de protocolo para a obtenção dos concentrados plasma rico em plaquetas (PRP) e fibrina rica em plaquetas (PRF) para o desenvolvimento de curativos cutâneos em modelo animal Resumo: Feridas na pele são lesões comuns que comprometem a qualidade de vida e geram altos custos nos sistemas de saúde. O tratamento geralmente envolve o uso de curativos mecânicos, biológicos ou artificiais. Objetivo: Este estudo teve como objetivo desenvolver curativos para feridas baseados em concentrados de plaquetas, especificamente plasma rico em plaquetas (PRP) e a fibrina rica em plaqueta (PRF), e avaliar sua eficácia no tratamento de feridas cutâneas em ratos Wistar. Metodologia: Os animais foram divididos em quatro grupos (n = 64/grupo), tratados com carbopol (controle negativo), PRP + carbopol, PRF + carbopol, ou PRF + CaCl2 + carbopol. As análises das feridas foram realizadas nos dias 3, 7, 14 e 21, considerando a área da ferida, taxa de contração e histopatologia do reparo tecidual. Resultados: Os resultados indicaram que o curativo à base de PRF foi mais eficaz na aceleração do fechamento das feridas nos estágios iniciais do reparo tecidual (até o dia 7). Nos estágios posteriores (dias 14 e 21), o PRF continuou a auxiliar significativamente no processo de colagenização e reparo tecidual. Por outro lado, o grupo tratado com PRF + CaCl2 mostrou uma resposta inflamatória mais pronunciada nos primeiros dias, acompanhada de maior formação de crostas (necrose), mas essa resposta inflamatória diminuiu após o dia 14. Conclusão: O curativo à base de PRF mostrou-se eficaz tanto na aceleração do fechamento inicial quanto no apoio ao reparo tecidual em fases posteriores, demonstrando potencial para ser utilizado em terapias avançadas para o tratamento de feridas cutâneas.; Abstract: Cutaneous wounds are common injuries that compromise quality of life and generate high costs for health systems. Treatment usually involves the use of mechanical, biological or artificial dressings. Objective: This study aimed to develop wound dressings based on platelet concentrates, specifically platelet-rich plasma (PRP) and platelet-rich fibrin (PRF), and to evaluate their efficacy in the treatment of skin wounds in Wistar rats. Methodology: The animals were divided into four groups (n = 64/group), treated with carbopol (negative control), PRP + carbopol, PRF + carbopol, or PRF + CaCl2 + carbopol. Wound analyses were performed on days 3, 7, 14 and 21, considering the wound area, contraction rate and histopathology of tissue repair. Results: The results indicated that the PRF-based dressing was more effective in accelerating wound closure in the early stages of tissue repair (up to day 7). In the later stages (days 14 and 21), PRF continued to significantly aid in the process of collagenization and tissue repair. On the other hand, the group treated with PRF + CaCl2 showed a more pronounced inflammatory response in the first days, accompanied by increased crust formation (necrosis), but this inflammatory response decreased after day 14. Conclusion: The PRF-based dressing was effective both in accelerating initial closure and in supporting tissue repair in later stages, demonstrating potential for use in advanced therapies for the treatment of cutaneous wounds. Orientadora: Dra. Kádima Nayara Teixeira; Coorientadora: Dra. Ana Carla Zarpelon Schutz; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Celular. Defesa : Palotina, 30/08/2024; Inclui referências; Área de concentração: Bioquímica e Biologia Molecular 2024-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/75470 Efeito do extrato aquoso do macrofungo Macrocybe titans sobre a formação de biofilme de Candida albicans e Candida tropicalis : morfologia do biofilme e expressão de genes de virulência Bertocco, André Rabelo Peixoto Resumo: Extratos de macrofungos têm sido estudados devido à grande variedade de seus bioprodutos. Para o cogumelo basidiomiceto Macrocybe titans existem poucos registros na literatura sobre o seu potencial antimicrobiano. Biofilmes são importantes fatores de virulência e resistência de micro-organismos, e a busca por novos agentes terapêuticos eficazes tem se tornado uma alternativa favorável ao combate às doenças infecciosas. As leveduras do gênero Candida são as principais causadoras de infecções oportunistas e nosocomiais, dentre suas espécies as mais incidentes são C. albicans e C. tropicalis. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivos elucidar o efeito do extrato aquoso de M. titans sobre a formação de biofilmes produzido por essas leveduras. O extrato aquoso foi preparado através da maceração do pó de basidiomas de M. titans em água purificada (1 g.mL-1). A atividade antibiofilme foi avaliada pelo método do cristal violeta, microscopia eletrônica de varredura e a microscopia de fluorescência (coloração por Calcofluor White), para biofilmes em formação e biofilmes pré-formados. A expressão de genes de virulência das leveduras nos biofilmes foi avaliada por qRT-PCR. Os primers utilizados foram, para C. albicans: UME6, CHT2 e ACT1b; e para C. tropicalis foram utilizados ALS1 e ACT1. Observouse que foi necessária a concentração de 32 mg.mL-1 para a inibição da formação de biofilmes em C. albicans, e de 16 mg.mL-1 para inibição de C. tropicalis. Os biofilmes formados de C. albicans e C. tropicalis foram desestruturados a partir das concentrações de 63 mg.mL-1 e 8 mg.mL-1, respectivamente. A análise das imagens corroborou os resultados do ensaio de cristal violeta, com a escassez de células nos biofilmes tratados em formação, e o aparecimento de espaços vazios entre os biofilmes pré-formados tratados, além de demonstrar a desconfiguração da parede celular das leveduras, com a formação de cicatrizes e rugosidades não características. Pôde-se observar a inibição da expressão dos genes UME6 e CHT2 nas células planctônicas tratadas tanto em formação, quanto pré-incubadas, bem como nas células sésseis de biofilme pré-formado, contudo, observou-se um pequeno aumento (~20%) na expressão gênica em biofilme em formação tratadas. Os resultados para o gene ALS1 se mostraram diminuídos para células planctônicas (~4 vezes menos expresso) e aumentados para células sésseis (de 1,5 a 2,5 vezes mais expresso). Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo teste t de Student utilizando-se a média e desvio padrão.; Abstract: Macrofungi extract has been studied because of its great bioproducts variability. There are few studies about the antimicrobial potential of the mushroom Macrocybe titans. Microbial biofilm is the main virulence and resistance factor, and the research for new efficient therapeutic agents is an alternative against infectious disease. Candida species are the major causes of opportunistic and hospital infections, the most incident species are C. albicans and C. tropicalis. Thus, this work aims to elucidate the M. titans aqueous extract inhibition capacity over the yeast's biofilm formation. The aqueous extract was prepared through the powder maceration of basidiomes in purified water (1 g.mL-1). The antibiofilm activity through the violet crystal method, microscopic electronic array and the fluorescence microscopy (calcofluor white dye) were analyzed to investigate the cells and biofilm structural modifications after treatment, for biofilm formation and preformed biofilms. The virulence gene expression was evaluated through qRT-PCR. The primers used were C. albicans: UME6, CHT2 and ACT-1b; and C. tropicalis ALS1 and ACT1. The C. albicans and C. tropicalis biofilm formation was inhibited at 32 mg.mL-1 and 16 mg.mL-1, respectively, and preformed biofilms were inhibited at 63 mg.mL-1 and 8 mg.mL-1. The images showed scarcity of biofilm cells in the biofilm formation treatment, and voids appearance in the pre-formed biofilms. The yeast's cell walls showed uncharacteristic scars and deformation. The planktonic cells showed UME6 and CHT2 expressions inhibited in biofilm formation and preformed biofilms, as well as the sessile preformed biofilm cells. Although sessile biofilms formation cells showed increased expression (~20%). The ALS1 gene was less expressed in planktonic cells (~4 times) and more expressed in sessile cells (~1,5 to 2,5 times). The data was evaluated with ANOVA and Student T Tests. Orientadora: Profa. Dra. Adriana Fiorini Rosado; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Multicêntrico em Bioquímica e Biologia Molecular. Defesa : Palotina, 14/02/2022; Inclui referências 2022-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/76553 Análise proteômica diferencial da raiz do trigo (Triticum aestivum VAR. LINI) CV. CD104 na ausência de nitrogênio e na presença da bactéria Herbaspirillum seropedicae SmR1 Gonzalez, Alessandro Augusto, 1977- Resumo: O nitrogênio (N) é limitante ao crescimento vegetal, tem influência na produtividade de cerais e é suprido com a utilização de fertilizantes nitrogenados. Entretanto os custos de produção e os problemas ambientais têm motivado os estudos de tecnologias alternativas ao uso do fertilizante. O emprego de microrganismos fixadores de nitrogênio em cereais, em especial para o trigo, tem sido estudado como uma das alternativas para o incremento de nitrogênio por características relacionadas à fixação ou à promoção do crescimento vegetal. Este trabalho teve como objetivo investigar proteínas presentes nas raízes da cultivar de trigo CD104 quando inoculadas com a bactéria H. seropedicae SmR1 na ausência de fonte de nitrogênio e carbono para compreender a fisiologia da planta e sua interação com a bactéria. Para tanto, sementes de trigo foram esterilizadas, pré-germinadas e transferidas para tubos de ensaio de vidro contendo meio de cultura MS líquido sem sacarose para obtenção do cultivo in vitro sob os tratamentos: com fonte de nitrogênio (CN), sem nitrogênio (SN) e sem nitrogênio com o inóculo da bactéria H. seropedicae SmR1 (SNI) adicionado aos tubos SN após 24 h da transferência das sementes para os tubos SN. Todos os tubos foram mantidos em sala de cultura a 25 °C e fotoperíodo de 14 h de luz por 20 dias. As raízes foram retiradas para avaliação do comprimento, massa seca e fresca, e para obtenção de extratos proteicos para análise proteômica por LC-MS/MS, tipo LTQ Orbitrap XL ETD. As imagens foram obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura de raízes intactas. Das proteínas, 1.069, foram identificadas seguindo critérios de restrições e comparadas com o banco de dados de proteínas UNIPROTKB de trigo e outros cereais. As informações sobre as vias metabólicas foram obtidas a partir de proteínas identificadas em cada tratamento, a partir de uma comparação de tratamentos emparelhados de proteínas exclusivas e mais abundantes. Observou-se que o comprimento, as massas e as vias metabólicas do tratamento SN foram mais distintas do CN e SNI. A proteína RUBISCO e outras como beta-1,3-glucanase e quitinases observadas no SNI sugerem atividade de fixação de carbono, respostas de hipersensibilidade e resistência a doenças em plantas promovidas pela bactéria. Um número muito baixo de bactérias endofíticas foi detectado. Um total de 211 proteínas exclusivas de H. seropedicae foram identificadas no tratamento SNI. As proteínas foram relacionadas à atividade de síntese, metabolismo de energia e carboidratos e atividade de fixação biológica de nitrogênio. Proteínas relacionadas ao metabolismo antioxidante, como a glutationa S-transferase, foram verificadas nas raízes do tratamento SN. Os resultados sugerem que as raízes do trigo na ausência de nitrogênio responderam a esta condição de estresse e, a presença promoveu respostas de estresse decrescentes à ausência de nitrogênio e algumas evidências de fixação biológica de nitrogênio na raiz.; Abstract: Nitrogen (N) is limiting plant growth, influences the productivity of cereals, and is supplied with nitrogen fertilizers. However, production costs and environmental problems have motivated studies in alternative technologies to the use of fertilizer. The use of nitrogen-fixing microorganisms in cereals, especially wheat, has been studied as one of the alternatives for increasing nitrogen in the plant and for characteristics related to fixing or promoting plant growth. The bacterium Herbaspirillum seropedicae SmR1 is a candidate for this purpose, as it interacts with several species of grasses, including wheat, leading to increased productivity. This study aimed to investigate proteins present in the roots of wheat cultivar CD104 when inoculated with the bacterium in the absence of nitrogen and carbon source to understand the physiology of the plant and its interaction with the bacteria. Wherefore, wheat seeds were sterilized, pre-germinated, and transferred to glass test tubes containing liquid MS culture media without sucrose to obtain in vitro cultivation under treatments: with nitrogen source (CN), without nitrogen (SN), and without nitrogen with the bacterium inoculum (SNI) added to SN tubes after 24 h of seed transfer to tubes of SN. All tubes were kept in a culture room at 25 °C and a photoperiod of 14 h of light for 20 days. The roots were taken for evaluation of length, dry and fresh mass, and to obtain protein extracts for proteomic analysis by LC-MS/MS, type LTQ Orbitrap XL ETD. Images were obtained by Scanning Electron Microscopy from intact roots. Proteins, 1069, were identified following criteria of restrictions and compared to the UNIPROTKB protein database of wheat and other cereals. Information on metabolic pathways was obtained from identified proteins in each treatment from a paired treatments comparison of exclusive and most abundant proteins. It was observed that the length, masses, and metabolic pathways of the SN treatment were more distinct from the CN and SNI. The RUBISCO protein and others as beta-1,3-glucanase and chitinases observed in SNI suggest the activity of carbon fixation, hypersensitivity responses, and resistance to diseases in plants promoted by the bacteria. A low number of endophytic bacteria were detected. A total of 211 exclusive proteins of H. seropedicae were identified in SNI treatment. Proteins were related to synthesis activity, energy and carbohydrate metabolism, and biological nitrogen fixation activity. Proteins related to antioxidant metabolism, as glutathione S-transferase, were verified in the roots of the SN treatment. The results suggest that wheat roots in the absence of nitrogen were responded to this condition and the presence, decreased responses to stress in the absence of nitrogen, and some pieces of evidence of biological nitrogen fixation in the root. Orientadora: Profa. Dra. Marise Fonseca dos Santos; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Palotina, Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Bioquímica e Biologia Molecular. Defesa : Palotina, 27/07/2021; Inclui referências: p. 88-101 2021-01-01T00:00:00Z