https://hdl.handle.net/1884/39642 2026-05-30T10:02:28Z https://hdl.handle.net/1884/101899 Desenvolvimento de um scFv adaptado para triagem/diagnóstico da doença renal crônica Resumo: O acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGEs) está associado a diversasdoenças, devido à má filtração renal, em especial com a progressão da Doença RenalCrônica (DRC). A dosagem desses analitos em soro de pacientes desperta grande interessepara fins diagnósticos e terapêuticos. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi a utilizaçãodo fragmento variável de cadeia única (scFv) de um anticorpo para a concepção de umbiossensor, que possa ser empregado em um teste de diagnóstico e favorecer a detecçãode AGEs em pacientes com DRC. Para tanto, soro albumina humana (HSA) foi modificadopara obtenção de carboximetillisina, a molécula CML, formando HSA-CML, que é um AGEamplamente estudado. O anticorpo monoclonal mAb2D6G2 serviu como protótipo naconstrução do scFv. O gene sintético codificante para o scFv foi clonado em vetor deexpressão para produção da molécula recombinante em sistema heterólogo. Acaracterização funcional do fragmento de anticorpo foi realizada por imunoensaios comoWestern Blotting e ELISA. A eficiência de glicação, de HSA-CML, foi demonstrada por meioda mobilidade eletroforética e confirmada por análise de espectrometria de massa. O scFvreagiu de maneira dose-dependente frente a HSA-CML evidenciado por ELISA, e manteveo mesmo perfil de reconhecimento à molécula-alvo quando comparado ao anticorpomonoclonal de origem. Nos experimentos de ELISA de competição o scFv foi eficiente emdetectar diferentes concentrações de HSA-CML presente nas amostras de soro humanocontaminado artificialmente. Um estudo mais detalhado desse scFv permitirá seu empregocomo biossensor para analisar soros de pacientes com DRC.; Abstract: The accumulation of advanced glycation end products (AGEs) is associated with variousdiseases due to impaired renal filtration, particularly with the progression of Chronic KidneyDisease (CKD). Measuring these analytes in patient serum has garnerated significantinterest for both diagnostic and therapeutic purposes. In this context, the objective of thisstudy was to utilize the single-chain variable fragment (scFv) of an antibody to develop abiosensor that could be employed in diagnostic tests, facilitating the detection of AGEs inCKD patients. To this end, human serum albumin (HSA) was modified to obtaincarboxymethyllysine (CML), forming HSA-CML, a well-studied AGE. The monoclonalantibody mAb2D6G2 was used as a prototype for devoloping the scFv. The synthetic genecoding for the scFv was cloned into an expression vector for the production of therecombinant molecule in a heterologous system. The functional characterization of theantibody fragment was performed using immunoassays including Western Blotting andELISA. The efficiency of HSA glycation to form HSA-CML was demonstrated throughelectrophoretic mobility and confirmed by mass spectrometry analysis. The scFv showeddose-dependent reactivity to HSA-CML, as evidenced by ELISA, and maintained the samerecognition profile for the target molecule when compared to the original monoclonalantibody. In competition ELISA experiments, the scFv successfully detected differentconcentrations of HSA-CML in artificially contaminated human serum samples. A moredetailed study of this scFv will allow its application as a biosensor to analyze serum samplesfrom CKD patients. Orientadora: Prof.ª(a). Dr(a). Larissa Magalhães Alvarenga; Coorientador: Profº. Dr. Wanderson Duarte da Rocha; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 28/10/2024; Inclui referências; Área de concentração: Microbiologia 2024-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/97981 Epidemiologia ambiental de parasitos em matrizes aquáticas e arenosas destinadas à prática de desportos profissionais e amadores no Paraná e Santa Catarina Resumo: A prática de desportos é um fator essencial para a manutenção da saúde. Contudo, modalidades esportivas praticadas em ambiente aberto, onde o contato é frequente com a água e areia, eventualmente contaminadas, pode representar um risco para os esportistas, especialmente por parasitos que apresentam ampla resistência ambiental como cistos de Giardia spp., oocistos de Cryptosporidium spp., e Toxoplasma gondii e, ovos de helmintos. O presente estudo traz um panorama da qualidade desses ambientes, especialmente durante a prática de competições esportivas realizada em dois estados do sul do Brasil. Ao redor do mundo, as legislações que regem a balneabilidade de ambientes utilizados para recreação em águas brutas e águas tratadas como as piscinas, não contemplam a pesquisa de parasitos. Do mesmo modo, esse aspecto não é contemplado no Brasil. Ressalta-se que a avaliação da qualidade parasitológica e microbiológica de ambientes aquáticos e arenosos realizada durante a execução de competições esportivas oficiais, nunca foi realizada. O principal objetivo desse estudo foi avaliar a qualidade sanitária de ambientes aquáticos e arenosos utilizados para a prática de diferentes modalidades esportivas por atletas profissionais, ou amadores no Estado do Paraná e Santa Catarina. Foram estabelecidas 16 áreas de práticas de esportes aquáticos e arenosos, como surf, Triathlon, travessias aquáticas, vôlei de piscina, tênis e futebol de areia, entre outros, de ambos os estados. No período de novembro de 2023 a dezembro de 2024, 50 amostras de diferentes matrizes hídricas (água do mar, água superficial e água de retrolavagem de piscinas) foram coletadas para pesquisa de protozoários patogênicos e bactérias indicadoras de contaminação fecal (BICF), e 95 amostras de areia para pesquisa de helmintos. As amostras hídricas foram analisadas pela técnica de filtração em membranas, seguida da purificação por separação imunomagnética e reação de imunofluorescência direta para a pesquisa de Cryptosporidium e Giardia. Todas as amostras foram submetidas à extração de DNA para realização de PCR e qPCR para detecção de ambos os protozoários intestinais e de T. gondii. A pesquisa de bactérias indicadoras de contaminação fecal (BICF) foi realizada por filtração em membranas, semeadura em meio cromogênico e contagem de colônias, seguido de identificação por MALDI-TOF. A detecção de helmintos em areia foi feita mediante homogeneização das amostras com Glicina 1M pH 5,5 ou Triton™ X - 100 (0,1%) de acordo com a composição granulométrica da areia, seguida de centrifugação ou centrífugo-flutuação, e posterior flutuação em sacarose d=1,24. A presença de ao menos um dos protozoários pesquisados foi detectada em 6 das 7 áreas aquáticas contempladas e analisadas no presente estudo, onde cistos de Giardia spp., foram detectados com maior frequência em águas salinas e doces, seguido da contaminação por T. gondii, detectado pela primeira vez em água do mar no Brasil, e em menor frequência, por Cryptosporidium spp. O monitoramento conjunto de duas BICF mostrou-se relevante para atestar a qualidade de ambientes aquáticos, especialmente para Enterococcus sp., onde as principais espécies isoladas foram E. faecalis/E. faecium e em menor frequência, E. gallinarum e E. hirae. Quanto a contaminação de areias, 14,7% das amostras (n=14/95) apresentaram contaminação por ovos de helmintos ou larvas de nematódeos. Em conclusão, o presente estudo demonstra importante contaminação dos ambientes aquáticos e arenosos utilizados para recreação e prática de desportos em dois estados do sul do Brasil. A avaliação da qualidade das águas e dos ambientes arenosos é relevante para a garantia da segurança e saúde de atletas profissionais ou amadores. Através do controle da qualidade desses ambientes, é possível identificar a presença e origem de contaminantes nocivos à saúde, podendo atuar como estratégia de prevenção de aquisição de doenças parasitárias; Abstract: Sports practice is an essential factor for maintaining health. However, sports practiced in outdoor environments, where there is frequent contact with water and sand, which may be contaminated, can pose a risk to athletes, especially due to parasites that have broad environmental resistance, such as Giardia spp., cysts, Cryptosporidium spp., oocysts, and Toxoplasma gondii and helminth eggs. The present study provides an overview of the quality of these environments, especially during sports competitions held in two southern states of Brazil. Around the world, legislation governing the bathing suitability of environments used for recreation in raw water and treated water, such as swimming pools, does not include parasite testing. Likewise, this aspect is not covered in Brazil. It is noteworthy that the evaluation of the parasitological and microbiological quality of aquatic and sandy environments carried out during official sports competitions has never been performed. The main objective of this study was to evaluate the sanitary quality of aquatic and sandy environments used for the practice of different sports modalities by professional or amateur athletes in the states of Paraná and Santa Catarina. Sixteen areas destined for the practice of aquatic and sandy sports, such as surfing, triathlon, water crossings, pool volleyball, tennis and beach soccer, among others, were established at both states. From November 2023 to December 2024, 50 samples of different water matrices (seawater, surface water and backwash pool water) were collected to search for pathogenic protozoa and fecal indicator bacteria (FIB), and 95 sand samples were collected to search for helminths. Water samples were analyzed by the membrane filtration technique, followed by purification by immunomagnetic separation and direct immunofluorescence reaction for the detection of Cryptosporidium and Giardia. All samples were subjected to DNA extraction followed by PCR and qPCR to detect both intestinal protozoa and T. gondii. FIB were screened by membrane filtration, chromogenic seeding and colony counting, followed by identification by MALDI-TOF. Helminths were detected in sand by homogenizing the samples with 1M Glycine pH 5.5 or Triton™ X - 100 (0.1%) according to the sand particle size composition, followed by centrifugation or centrifugal flotation, and subsequent flotation in sucrose d=1.24. The presence of at least one of the protozoa studied was detected in 6 of the 7 aquatic areas covered and analyzed in this study, where cysts of Giardia spp. were detected more frequently in saline and fresh waters, followed by contamination by T. gondii, detected for the first time in seawater in Brazil, and less frequently, by Cryptosporidium spp. The concomitant monitoring of two FIB proved to be relevant to attest the quality of aquatic environments, especially for Enterococcus sp., where the main isolated species were E. faecalis/E. faecium and to a less frequently, E. gallinarum and E. hirae. Regarding sand contamination, 14.7% of the samples (n=14/95) showed contamination by helminth eggs or nematode larvae. In conclusion, this study demonstrates significant contamination of aquatic and sandy environments used for recreation and sports in two southern states of Brazil. Assessing the quality of water and sandy environments is important to ensure the safety and health of professional and amateur athletes. By controlling the quality of these environments, it is possible to identify the presence and origin of contaminants that are harmful to health and can act as a strategy to prevent the acquisition of parasitic diseases Orientador: Prof. Dr. Diego Averaldo Guiguet Leal; Coorientadores: Drª Maria Aparecida Moraes Marciano e Prof.ª. Drª. Keite da Silva Nogueira; Banca: Diego Averaldo Guiguet Leal (Presidente da Banca), Ricardo Toshio Fujiwara e Ida Chapal Pimentel; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de CIências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 30/05/2025; Inclui referências; Área de concentração: Microbiologia 2025-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100960 Caracterização de anticorpos monoclonais anti-toxinas do veneno de Bothrops jararaca Resumo: Por ano, no mundo, mais de 5 milhões de indivíduos sofrem acidentes com serpentes. No Brasil, são notificados cerca de 30 mil casos por ano, sendo o gênero Bothrops sp. responsável por 80% dos acidentes, seguido do gênero Crotalus sp.. O veneno dessas serpentes é composto em sua maioria por metaloproteinases, toxinas responsáveis principalmente pelos distúrbios de coagulação causados no envenenamento. Atualmente, o diagnóstico do ofidismo é realizado através da identificação da serpente e da sintomatologia do paciente, o que frequentemente induz a erros no tratamento, o qual consiste na aplicação de soros heterólogos gêneroespecíficos. Apesar dos antivenenos serem o único tratamento eficaz para os efeitos sistêmicos do envenenamento, eles podem causar reações adversas e apenas 5% dos anticorpos presentes neutralizam efeitos tóxicos do veneno. No Brasil, já foram desenvolvidos testes que auxiliam na identificação das espécies causadoras da mordida, contudo a maioria é baseado em uma mistura de anticorpos policlonais, o que impede a reprodutibilidade do ensaio. Pensando nisso, nosso grupo produziu anticorpos monoclonais (mAbs) anti-toxinas do veneno de Bothrops jararaca e esse trabalho visou a caracterização imunoquímica e funcional dos anticorpos, além de desenvolver um diagnóstico diferencial in vitro para o ofidismo causado por serpentes do gênero Bothrops sp. e Crotalus sp.. Dessa forma, foram caracterizados 4 anticorpos por ELISA e Western Blot, os mAbs 1C10E7 e 5C7F9 apresentaram reatividade contra proteínas contidas nos venenos de B. jararaca, B. alternatus e B. neuwiedi. Já o anticorpo 3A7B9 reconheceu componentes presentes nos venenos de todas as espécies de Bothrops sp. testadas e não apresentou reatividade cruzada com veneno de Crotalus durissus terrificus, Lachesis muta e Micrurus frontalis. O anticorpo 1B9F1 apresentou o mesmo perfil do mAb 3A7B9, contudo reconheceu o veneno de C. d. terrificus e L. muta cruzadamente. A fim de identificar os alvos dos anticorpos, foi realizado o mapeamento de epitopos das principais toxinas presentes nos venenos e análise por espectrometria de massas. Os resultados obtidos indicam que os possíveis ligantes para os anticorpos 1C10E7, 1B9F1 e 3A7B9 são metaloproteinases. Ademais, a purificação de uma classe de metaloproteinases por cromatografia de hidrofobicidade e um ELISA frente às frações purificadas corroborou que os possíveis alvos dos mAbs 1C10E7, 1B9F1 e 3A7B9 são metaloproteinases do tipo P-II ou P-III. Foi avaliada a capacidade dos anticorpos em inibir os efeitos deletérios dos venenos, e não foi observada proteção dos mAbs 1C10E7 e 3A7B9 frente às atividades fibrinogenolítica e caseinolítica das metaloproteinases. Além disso, foi possível obter as sequências aminoacídicas completas das regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos 3A7B9 e 1C10E7. Por fim, foi desenvolvido um teste diagnóstico diferencial in vitro para acidentes causados por Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus utilizando a mistura dos anticorpos 1C10E7 e 3A7B9 o qual apresentou um limite de detecção de toxinas de 60 ng.mL-1 em soros contaminados artificialmente com diferentes venenos. Esses resultados reforçam a importância da produção e emprego dos anticorpos monoclonais no estudo e detecção das toxinas ofídicas. Palavras-chave: Bothrops jararaca; envenenamento; anticorpos monoclonais; diagnóstico; metaloproteinases; Abstract: Every year, more than 5 million people are bitten by snakes around the world. In Brazil, around 30 thousand cases are reported and the genus Bothrops sp. is responsible for 80% of the accidents, followed by the genus Crotalus sp. The venom of these snakes is mostly composed of metalloproteases, toxins mainly responsible for the coagulation disorders in the envenomation. Currently, the diagnosis of snakebite is made through the identification of the snake and the patient’s symptoms which often leads to errors in treatment as it consists in the application of heterelogous genumspecific serums. Although antivenoms are the only effective treatment for the systemic effects of envenomation, they may cause adverse reactions and only 5% of the present antibodies neutralize the toxic effects of the venom. In Brazil, tests have already been developed to identify the species that cause biting, however the majority are based on a mixture of polyclonal antibodies, which inhibits reproducibility. Considering this, our group produced monoclonal antibodies (mAbs) against toxins of Bothrops jararaca venom and this work aimed at the immunochemical and functional characterization of the antibodies, in addition to developing an in vitro differential diagnosis for snakebite caused by snakes of the genus Bothrops sp. and Crotalus sp.. Thus, 4 antibodies were characterized by ELISA and Western Blot, mAbs 1C10E7 and 5C7F9 showed reactivity against proteins present in the venoms of B. jararaca, B. alternatus and B. neuwiedi. The 3A7B9 antibody recognized proteins in the venoms of all species of Bothrops sp. tested and showed no cross-reactivity with Crotalus durissus terrificus and Lachesis muta venom. The 1B9F1 antibody presented the same profile as the 3A7B9 mAb, however cross-reacted with the C. d. terrificus and L. muta venom. In order to identify the antigen of the antibodies, a SPOT assay and mass spectrometry were used and the tests suggested that the possible targets of antibodies 1C10E7, 1B9F1 and 3A7B9 are metalloproteinases from snake venom. Furthermore, the purification of a class of metalloproteinases by hydrophobic chromatography and an ELISA against the purified fractions corroborated that the possible targets of mAbs 1C10E7, 1B9F1 and 3A7B9 are type P-II or P-III metalloproteinases. Moreover, the neutralization capacity of antibodies 1C10E7 and 3A7B9 against the fibrinogenolytic and caseinolytic activity of metalloproteinases was not observed through activity assays. Besides that, it was possible to obtain the complete amino acid sequences of the variable domains of the heavy and light chains of the 3A7B9 and 1C10E7 antibodies. Finally, an in vitro differential diagnostic test was developed for accidents caused by Bothrops jararaca and Crotalus durissus terrificus using a mixture of antibodies 1C10E7 and 3A7B9, which presented a toxin detection limit of 60 ng.mL-1 in serum artificially contaminated with different venoms. The results presented so far reinforce the importance of the production and use of monoclonal antibodies in the study and detection of snake toxins Orientadora: Profa. Larissa Magalhães Alvarenga; Coorientadoras: Profa. Dra. Alessandra Becker Finco e Profa. Dra. Juliana Ferreira de Moura; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 29/11/2024; Inclui referências 2024-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100797 Pesquisa da heterorresistência à vancomicina em Staphylococcus aureus isolados de pacientes em ambiente hospitalar Resumo: Staphylococcus aureus é um microrganismo gram-positivo envolvido em infecções cutâneas e sistêmicas. Cepas de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) estão associadas a elevada morbimortalidade e são classificadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como prioridade crítica no enfrentamento da resistência antimicrobiana. Desde 1997, tem sido relatado o aumento na detecção do fenótipo de heterorresistência à vancomicina (hVISA) entre isolados MRSA. Essa forma de resistência pode não ser detectada por métodos laboratoriais convencionais, pois apresenta concentração inibitória mínima (CIM) aparentemente suscetível embora abrigue subpopulações resistentes. Considerando que tal fenótipo pode comprometer a eficácia terapêutica da vancomicina em infecções por S. aureus, o objetivo do estufoi avaliar a presença de heterorresistência à vancomicina em isolados clínicos de MRSA obtidos de pacientes atendidos no Complexo Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (CHC-UFPR). Entre março de 2023 e março de 2025, 95 isolados de MRSA provenientes de hemoculturas, lavado broncoalveolar, aspirado traqueal, abscessos, biópsias, escarro, secreções e urina foram selecionados. Todos os isolados incluídos no estudo tiveram a identificação confirmada por espectrometria de massa (MALDI-TOF), e a detecção do mecanismo de resistência à meticilina por reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção do gene mecA. O teste de sensibilidade antimicrobiana foi realizado pelo sistema automatizado Phoenix BD ® e a pesquisa de heterorresistência à vancomicina por triagem em ágar BHI com 4 µg/mL de vancomicina. Dados clínicos e sociodemográficos foram obtidos dos prontuários dos pacientes. Para a análise estatística foram realizados os testes Qui-quadrado ou teste exato de Fisher e estimadores de Kaplan-Meier, utilizando o software R versão 4.5.1. Adotou-se nível de significância de 5%. Os resultados das CIMs de vancomicina variaram de 0,5 a 2,0 µg/mL, sendo que a maior parte dos isolados (n=63, 66,3%) apresentou valor de CIM igual a 1,0 µg/mL. Nas amostras estudadas, não foi observado o fenótipo hVISA. Os isolados demonstraram resistência à eritromicina (n=84, 91,3%), ciprofloxacino (n=62, 65,3%) e clindamicina (n=50, 53,8%). Houve associação entre infecção por MRSA e internação em UTI (p=0.001). A diferença entre as curvas de sobrevivência, de acordo com local de atendimento hospitalar foi estatisticamente significativa tanto para o óbito geral (p = 0,0092) quanto para o óbito em até 30 dias após a infecção (p = 0,0037). A obtenção de CIMs próximas ao ponto de corte, reforça a importância da vigilância microbiológica contínua e monitoramento do perfil de resistência desse patógeno; Abstract: Staphylococcus aureus is a Gram-positive microorganism involved in both cutaneous and systemic infections. Methicillin-resistant S. aureus (MRSA) strains are associated with high morbidity and mortality and are classified by the World Health Organization (WHO) as a critical priority in the global response to antimicrobial resistance. Since 1997, an increase in the detection of the vancomycin heteroresistance phenotype (hVISA) among MRSA isolates has been reported. This form of resistance may not be detected by conventional laboratory methods, as it exhibits an apparently susceptible minimum inhibitory concentration (MIC) despite harboring resistant subpopulations. Considering that this phenotype may compromise the therapeutic efficacy of vancomycin in S. aureus infections, the aim of this study was to assess the presence of vancomycin heteroresistance in clinical MRSA isolates obtained from patients treated at the Hospital de Clínicas Complex of the Federal University of Paraná (CHC UFPR). Between March 2023 and March 2025, 95 MRSA isolates obtained from blood cultures, bronchoalveolar lavage, tracheal aspirates, abscesses, biopsies, sputum samples, secretions, and urine were selected. All isolates included in the study had their identification confirmed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrometry (MALDI-TOF), and methicillin resistance was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) detection of the mecA gene. Antimicrobial susceptibility testing was performed using the BD Phoenix® automated system, and screening for vancomycin heteroresistance was conducted on BHI agar containing 4 µg/mL of vancomycin. Clinical and sociodemographic data were obtained from patients’ medical records. Statistical analyses were performed using the chi-square test or Fisher’s exact test, as well as Kaplan–Meier estimators, with R software version 4.5.1. A significance level of 5% was adopted. Vancomycin MIC values ranged from 0.5 to 2.0 µg/mL, with the majority of isolates (n = 63, 66.3%) presenting an MIC of 1.0 µg/mL. The hVISA phenotype was not observed in the samples analyzed. The isolates showed resistance to erythromycin (n = 84, 91.3%), ciprofloxacin (n = 62, 65.3%), and clindamycin (n = 50, 53.8%). An association was observed between MRSA infection and intensive care unit (ICU) admission (p = 0.001). Differences between survival curves according to the hospital care setting were statistically significant for both overall mortality (p = 0.0092) and 30-day mortality after infection (p = 0.0037). MIC values approaching the breakpoint reinforce the importance of continuous microbiological surveillance and monitoring of the resistance profile of this pathogen Orientadora: Prof.ª Dr.ª Keite da Silva Nogueira; Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Camila Marcon; Banca: Keite da Silva Nogueira (Presidente da Banca), Dilair Camargo de Souza e Laura Lucia Cogo; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 26/06/2025; Inclui referências; Área de concentração: Microbiologia 2025-01-01T00:00:00Z