https://hdl.handle.net/1884/39637 2026-05-21T21:25:49Z https://hdl.handle.net/1884/102086 Aplicação de um novo modelo de epiderme humana reconstituída in vitro para avaliação de irritantes cutâneos Resumo: O desenvolvimento de metodologias alternativas tem se mostrado cada vez maisimportante para a aplicação do princípio dos 3 Rs (Replacement, Reduction andRefinement). Dentro desse contexto, a Epiderme Humana Reconstruída (RHE –Reconstructed Human Epidemis) é um modelo capaz de simular as característicasmorfológicas, bioquímicas e fisiológicas da epiderme humana, podendo ser utilizadopara diversos fins científicos, por exemplo, na avaliação da toxicidade desubstâncias químicas. Apesar de esse modelo ter elevada aceitação no contexto datoxicologia regulatória, ele é ainda pouco adotado em pesquisas acadêmicas,principalmente devido aos altos custos, dificuldades de aquisição e limitações deinformações acerca do protocolo de construção. Frente a isso, nosso objetivo foidesenvolver um novo modelo de RHE, aqui referido como Skinvitro-RHE, por meioda análise de fatores que potencialmente influenciam culturas de RHE (i.e..recobrimento dos insertos, placa de cultivo, densidade de poros dos insertos, meiode cultura, suplementos do meio de cultura, tempo de condição submersa, umidadee idade dos doadores de queratinócitos). A partir dessa análise, elaboramos umprotocolo aberto, a fim de aumentar a acessibilidade do modelo de RHE paralaboratórios acadêmicos e estudos que não se enquadram nas condições de BoasPráticas de Laboratório (BPL). Além disso, como segundo objetivo do trabalho,avaliamos a aplicabilidade desse modelo no teste de irritação dérmica in vitro,seguindo o método OECD TG 439. A melhor condição de construção da RHE foi ageração de um modelo construído com queratinócitos neonatais, plaqueados eminsertos de alta densidade de poros e revestidos com colágeno IV. Por meio desseprotocolo de construção, obtivemos uma RHE altamente similar à epiderme humanacom as quatro camadas de diferenciação e estrato córneo bem definido (~ 7camadas, 66,7 µm de espessura). Além disso, quando exposta a marcadores dediferenciação (Queratina-10, Queratina-14, Filagrina, Involucrina), apresentoupadrão de marcação semelhante à epiderme humana. Este modelo também seenquadrou nos parâmetros de controle de qualidade preconizados pela OECD TG439 e, assim, demonstrou boa viabilidade celular (densidade óptica média em 570nm de 1,7 ± 1,08) e função de barreira (IC50 de 2,77 ± 0,53 mg/mL - Dodecil Sulfatode Sódio). A Skinvitro-RHE foi, então, avaliada quanto ao seu potencial de uso paraavaliação de irritação dérmica por meio de 15 substâncias de referência (7 irritantese 8 não irritantes), usualmente empregadas em estudos de avaliação. Os resultadosmostraram que a Skinvitro-RHE foi capaz de discriminar substâncias irritantes denão irritantes, apresentando especificidade de 85,71 %, sensibilidade de 100 % eprecisão de 93,33 %. Em conclusão, esses resultados demonstram que a Skinvitro-RHE é um modelo promissor, acessível e altamente reprodutível, que pode serutilizado para teste de irritação dérmica, bem como outras finalidades científicas pormeio de seu protocolo aberto, contribuindo para a disseminação e implementação demétodos alternativos, principalmente em setores em que esse modelo 3D ainda nãoé bem difundido.; Abstract: The development of alternative methodologies has been shown to be increasinglyimportant for the application of the principle of 3 Rs (Replacement, Reduction andRefinement). Within this context, the Reconstructed Human Epidemic (RHE) is amodel capable of simulating the morphological, biochemical and physiologicalcharacteristics of the human epidermis, and can be used for various scientificpurposes, for example, in the evaluation of the toxicity of chemical substances.Although this model is highly accepted in the context of regulatory toxicology, it is stilllittle adopted in academic research, mainly due to high costs, difficulties in acquisitionand limitations of information about the construction protocol. In view of this, ourobjective was to develop a new model of RHE, here referred to as Skinvitro-RHE,through the analysis of factors that potentially influence cultures of RHE (i.e.,coverings of the inserts, cultivation plate, pore density of the inserts, culture medium,culture medium supplements, time in submerged condition, humidity and age ofkeratinocyte donors). From this analysis, we developed an open protocol in order toincrease the accessibility of the RHE model for academic laboratories and studiesthat do not fit the Good Laboratory Practices (GLP) conditions. In addition, as asecondary objective of the study, we evaluated the applicability of this model in thedermal irritation test in vitro, following the OECD TG 439 method. The bestconstruction condition for the RHE was the generation of a model constructed withneonatal keratinocytes, plated in high-density pore inserts and coated with collagenIV. Through this construction protocol, we obtained an RHE highly similar to thehuman epidermis with the four layers of differentiation and well-defined stratumcorneum (~ 7 layers, 66.7 µm thick). In addition, when exposed to differentiationmarkers (Keratin-10, Keratin-14, Filaggrin, Involucrin), it presented a marking patternsimilar to the human epidermis. This model also fits the quality control parametersrecommended by OECD TG 439 and, thus, demonstrated good cell viability (meanoptical density at 570 nm of 1,7 ± 1,08) and barrier function (IC50 of 2,77 ± 0,53mg/ml - Sodium Dodecyl Sulfate). The Skinvitro-RHE was then evaluated for itspotential use for the evaluation of dermal irritation using 15 reference substances (7irritants and 8 non-irritants), usually used in evaluation studies. The results showedthat the Skinvitro-RHE was able to discriminate between irritating and non-irritatingsubstances, with a specificity of 85.71%, sensitivity of 100% and precision of 93.33%.In conclusion, these results demonstrate that the Skinvitro-RHE is a promising,accessible and highly reproducible model, which can be used for skin irritationtesting, as well as other scientific purposes through its open protocol, contributing tothe dissemination and implementation of alternative methods, especially in sectorswhere this 3D model is not yet widespread. Orientadora: Profa. Dra. Daniela Morais Leme; Coorientadora: Dra.Cynthia Bomfim Pestana; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 29/03/2021; Inclui referências 2021-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/61044 Estudo de algumas características biológicas dos portadores do antígeno Austrália em amostras da populaçao da Bahia e de Sergipe Orientador: Prof. Dr. Newton Freire-Maia; Dissertaçao (mestrado) -Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em Genética Humana; Inclui referências: p. 70-86 1977-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100520 Estudo demográfico, antropológico e genético das populaçoes da Costa da Lagoa e de Sao Joao do Rio Vermelho, na Ilha de Santa Catarina Resumo: As comunidades da Costa da Lagoa (CLG) e de São João do Rio Vermelho (SJRV), na Ilha de Santa Catarina, são conhecidas por descender de imigrantes do arquipélago dos Açores, com uma menor contribuição de africanos sub-saarianos e ameríndios. A colonização da ilha por não ameríndios começou durante o século XVffl. Desde então, uniões entre pessoas de diferentes origens vêm ocorrendo. Durante muitas décadas, SJRV e CLG permaneceram isoladas das comunidades vizinhas. Depois de 1970, SJRV começou a receber imigrantes e muitos de seus habitantes saíram para as vilas próximas, enquanto CLG continuou parcialmente isolada. Os objetivos deste estudo foram analisar a estrutura populacional, a diversidade genética e estimar a contribuição relativa dos diferentes grupos étnicos para o atual "pool gênico" das duas comunidades. Marcadores genéticos das hemácias do sangue e das proteínas séricas foram tipados por métodos convencionais. PCR-SSCA foi usado para identificar os genótipos HLA-DRA e PCR-SSOP para os outros genes HLA (DRB1, DRB3, DRB5, DQA1, DQB1) nas amostras das duas populações (SJRV, n»150; CLG, n*120). Freqüências alélicas (fa), genotípicas (fg) e haplotípicas (fli) foram estimadas por métodos padronizados. Os valores de mistura foram estimados pelo método de quadrado médio, utilizando-se as freqüências alélicas dos locos ABO, RHD, RHCE, GPA, GPB, HBB, HP, TF, CP, AK1, ACPI e DRB1. A maior diversidade em SJRV está de acordo com a história recente e a estrutura da população, uma vez que os haplótipos mais freqüentes nestas comunidades também o são em Europeus (os mais freqüentes são DRA *0101-DRB1 *0701-DQA1*0201-DQB1 *0201, fh=0,163 na CLG e 0,117 em SJRV, junto com DRA*0102-DRB1 *1501-DRB5*0101-DQA1*0102-DQB1 *0602). Haplótipos tipicamente africanos (DRB1*1503-DQA1 *0102-DQB1*0602 e DRB1*03021-DQA1*0401- DQB1*0402), caucasóides (DRB1 *0801-DQA1 *0401-DQB1*0402) e ameríndios (DRB1*16021- DQA1 *0501-DQB1 *0301; DRB1*0807-DQA1*0401-DQB1*0402 ou DRB 1*0411-DQA 1*0401- DQB1 *0402) foram vistos em ambas as populações. SJRV tem recebido mais imigrantes durante a última geração enquanto o endocruzamento na CLG ainda é alto (F=500xl0's). Dados revelam uma constituição triíbrida para SJRV e CLG. Os componentes étnicos das populações estudadas podem ser quantificados como segue: para CLG, 18,9% de africanos sub-saarianos (A), 77,9% de europeus iberos (P) e 3,2% de sul ameríndios (I); para SJRV, A=33,4%, P=57,4% e 1=9,2%. Devido às freqüências alélicas do loco GPB, em SJRV, terem sido incomuns, provavelmente em conseqüência da deriva genética, os valores de mistura foram recalculados após exclusão de GPB, ficando: A=10,2%; P=73,9% e 1=15,9%. A diversidade total (HT) foi estimada como 50,58%, dos quais 99,6% podem ser atribuídos à variabilidade intra-populacional (Hs). A variação genética inter-populacional (ou distância padrão, Dst) corresponde a 0,21%, enquanto o coeficiente de diferenciação gênica é 0,32%, indicativo de baixa diferença genética. Os resultados levam a concluir que a deriva genética pode ter tido um efeito importante na CLG, enquanto o fluxo gênico poderia ser o fator evolutivo atualmente predominante, potencialmente capaz de alterar as freqüências alélicas em SJRV. Embora tenha ocorrido alguma diferenciação entre as duas comunidades (Da= 0,168 em relação a 23 alelos DRBI), a distância genética de Nei, considerando 10 locos (sistemas sangüíneos eritrocitários, protéicos e enzimáticos; Da= 0,012) mostrou-as relativamente próximas; Abstract:The Costa da Lagoa (CLG) and São João do Rio Vermelho (SJRV) communities, in the Island of Santa Catarina, are known to descendent of immigrants from the Azores Archipelago, with a minor contribution of sub-Saharan Africans and of Amerindians. Settlement of the Island by non-Amerindians began during the 18* century. Since then, intermarriage between people of dififerent origins has been occurring. During many decades, SJRV and of CLG remained isolated from neighboring communities. After 1970, SJRV started to receive immigrants and many of its inhabitants emigrated to neighboring villages, while CLG continued partially isolated. The objectives of this study were to analyze the population structure, the genetic diversity and to estimate the relative contribution of the dififerent ethnic groups to the current gene pool of the two communities. Blood red cell and serum protein genetic markers were typed through conventional methods. PCR-SSCA was used to identify HLA-DRA genotypes and PCR-SSOP for the other HLA genes (DRB1, DRB3, DRB5, DQA1, DQB1) in the two population samples (SJRV, n«150; CLG, n«120). Allele (af), genotype (gf) and haplotype frequencies (hf) were estimated by standard methods. The values of admixture were obtained by the weighted least-squares method based on the allelic frequencies of the loci ABO, RHD, RUCE, GPA, GPB, HBB, HP, TF, CP, AK1, ACPI and DRB1. Higher diversity in SJRV is in accordance with recent history and population structure, since haplotypes presenting highest frequencies in these communities are common in Europeans (the most frequent are DRA*0101-DRB1*0701-DQA1*0201-DQB1*0201, hfN).163 in CLG and 0.117 in SJRV, together with the DRA*0102-DRB1*1501-DRB5*0101-DQA1*0102-DQB1 *0602). Typically African (DRB1*1503-DQA1 *0I02-DQB1 *0602 and DRB1 *03021-DQA1 *0401-DQB1 *0402), Caucasoid (DRB1 *0801-DQA1 *0401-DQB1 *0402) and Amerindian (DRB1*16021-DQA1*0501-DQB1*0301; DRB1*0807-DQA1 *0401-DQB1*0402 or DRB1 *0411-DQA1 *0401-DQB1*0402) haplotypes were seen in both populations. SJRV received more immigrants during the last generation, while inbreeding in CLG is still high (F = 500xl0'5). Data reveal a trihybrid constitution of SJRVs and CLG’s populations. The origins of the studied populations can be quantified as follows: for CLG, sub-Saharan Africans (A)=18.9%, Iberian Europeans (P)=77.9% and Southern Amerindians (I)=3.2%; for SJRV, A=33.4%, P=57.4% and 1=9.2%. Because allele frequencies of the GPB locus in SJRV were unusual, possibly as a consequence of random genetic drift, the values of admixture were recalculated after exclusion of GPB: A=10.2%; P=73.9% and 1=15.9%. The total diversity (HT) was estimated as 50.58%, of which 99.6% can be attributed to the intra-populational variability (Hs). The inter-populational genetic variation (or standard distance, Dst) corresponds to 0.21%, while the gene diflferentiation coefiBcient is 0.32%, indicative of low genetic difiference. The results led to the conclusion that random genetic drift may have an important effect in CLG, while presently gene flow might be the predominant evolutionary fàctor potentially changing allele frequencies in SJRV. Although there is some diversification of the two communities (Da= 0.168 based on 23 DRB! alleles), Nei’s genetic distance based on 10 loci (Da=0.012) showed them to still be closely related Orientadora: Maria Luiza Petzl-Erler; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas 2001-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100391 O papel do miR 1257 no câncer de mama Resumo: O câncer de mama é a neoplasia mais frequentemente diagnosticada em mulheres e a principal causa de morte por câncer em mulheres. Aproximadamente 90% das variantes genéticas associadas ao câncer de mama estão localizadas em regiões não codificadoras, incluindo sequências alvo de microRNAs (miRNAs). Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) localizados na região 3'UTR de alvos de miRNAs podem interferir com o seu sítio de ligação, reduzindo sua efetividade ou abolindo a repressão mediada pelo miRNA. Entre as predições obtidas previamente no trabalho in silico, foi verificada que a região 3’UTR do gene MDM4 é alvo de interação com microRNAs através de miRSNPs. Por ser um regulador negativo da atividade de transativação da proteína supressora tumoral p53, MDM4 assim como seu homólogo estrutural, MDM2 exercem um importante papel pró-oncogênico em várias neoplasias, dentre elas o câncer de mama. Dessa forma, os objetivos do presente trabalho foram investigar o papel do miR-1257, na interação com o seu alvo predito miRSNP rs10900596 T>C localizado em 3’UTR de MDM4, bem como avaliar os efeitos da radiação UV e da superexpressão do miR-1257 na expressão relativa dos genes MDM2, MDM4 e suas isoformas, além de verificar quais parâmetros de malignidade nas linhagens tumorais de mama ZR-75-1 e MDA-MB-231 podem ser modificados pela ação do miR-1257. A análise de interação empregando o sistema repórter luciferase demonstrou que o miR-1257 interage com a região alvo contendo o alelo C do rs10900596 de MDM4 (p= 0,0175) preconizada pelo estudo de bioinformática mas essa ligação não é afetada pela variação alélica do miRSNP presente nesse sítio de ligação. O miR-1257 também possui sítios de ligação em 3’UTR de MDM2. Os resultados obtidos mostraram que o miR1257 afeta a expressão relativa de MDM2 na linhagem ZR-75-1. A radiação ultravioleta aumentou a expressão relativa da isoforma MDM4-211 na linhagem ZR-75-1, que sem o efeito genotóxico não apresentava essa isoforma. Observou-se um efeito sinérgico da combinação do miR-1257 e da UV na expressão das isoformas de MDM4, especialmente da isoforma MDM4-FL nas linhagens tumorais de mama contrastantes ZR-75-1 e MDA-MB-231. O miR1257 apresenta um efeito supressor tumoral no câncer de mama, uma vez que essa molécula foi capaz de reduzir a viabilidade celular, aumentar as taxas de morte celular e interferir negativamente na proliferação de células de linhagens de câncer de mama distintas; Abstract: Breast cancer is the most frequently diagnosed neoplasm in women and the leading cause of cancer death in women. Approximately 90% of the genetic variants associated with breast cancer are located in non-coding regions, including target sequences of microRNAs (miRNAs). Single nucleotide polymorphisms (SNPs) located in the 3'UTR region of miRNA targets can interfere with their binding site, reducing their effectiveness or abolishing miRNAmediated repression. Among the predictions obtained previously in the in silico study, it was verified that the 3'UTR region of the MDM4 gene is the target of interaction with microRNAs through miRSNPs. As a negative regulator of the transactivation activity of the tumor suppressor protein p53, MDM4, as well as its structural homologue MDM2, plays an important pro-oncogenic role in several neoplasms, including breast cancer. Thus, the objectives of the present study were to investigate the role of miR-1257 in the interaction with its predicted target miRSNP rs10900596 T>C located in 3'UTR of MDM4, as well as to evaluate the effects of UV radiation and overexpression of miR-1257 in the relative expression of the genes MDM2, MDM4 and their isoforms, in addition to verifying which parameters of malignancy in the breast tumor lines ZR-75-1 and MDA-MB-231 can be modified by the action of this miRNA. The interaction analysis using the luciferase reporter system showed that miR-1257 interacts with the target region containing the C allele of MDM4 rs10900596 (p=0.0175) predicted by the bioinformatics study, but this binding is not affected by the allelic variation of the miRSNP present at this binding site. miR-1257 also has binding sites on the 3'UTR of MDM2. The results obtained showed that miR-1257 affects the relative expression of MDM2 in the ZR-75-1 cell line. Ultraviolet radiation increased the relative expression of the MDM4-211 isoform in the ZR-75-1 cell line, which, without the genotoxic effect, did not present this isoform. A synergistic effect of the combination of miR-1257 and UV was observed on the expression of MDM4 isoforms, especially the MDM4-FL isoform in the contrasting breast tumor lines ZR-75-1 and MDA-MB-231. miR-1257 has a tumor suppressor effect on breast cancer, since this molecule was able to reduce cell viability, increase cell death rates and negatively interfere with the proliferation of cells from different breast cancer lineages Orientadora: Profa. Dr.ª Karin Braun Prado; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 30/09/2022; Inclui referências 2022-01-01T00:00:00Z