https://hdl.handle.net/1884/39618 2026-04-15T09:44:27Z https://hdl.handle.net/1884/98636 Caracterização da enzima N-acetil-L-glutamatoquinase (NAGK) e sua possível interação com as proteínas PII (GlnZ e GlnB) em Azospirillum brasilense Resumo: A alfa-proteobactéria Azospirillum brasilense é amplamente estudada e possui relevância econômica devido à sua capacidade de promover o crescimento vegetal por meio da fixação biológica de nitrogênio e da produção de fitormônios. Entre as vias envolvidas no destino do nitrogênio fixado, destaca-se a biossíntese de arginina, na qual a N-acetil-L-glutamato quinase (NAGK) catalisa uma etapa regulatória a partir do glutamato em organismos que realizam o ciclo de síntese de ornitina. A arginina é um aminoácido-chave como fonte de nitrogênio, atuando como precursora de poliaminas em A. brasilense e da ureia, compostos que podem ser transferidos à planta hospedeira durante a associação. Em microrganismos, a NAGK pode apresentar duas formas estruturais: dimérica, insensível à arginina (como em E. coli), e hexamérica, sensível à arginina (como em cianobactérias). Nessa última, a regulação é mediada por proteínas PII, reguladoras e transdutoras de sinal, interação que não ocorre em E. coli. Em A. brasilense, entretanto, não há dados consolidados sobre a interação entre as PII (GlnB e GlnZ) e a NAGK hexamérica. Considerando a relevância dessa via, o presente trabalho buscou caracterizar a NAGK de A. brasilense (AbNAGK) quanto à atividade enzimática, estrutura e interação com as proteínas PII GlnZ e GlnB, além de avaliar a influência de metabólitos e modificações estruturais sobre sua função. Para atingir esses objetivos, a proteína foi purificada com cauda de histidina e também em sua forma nativa, a partir de vetores de produzidos em E. coli. As proteínas NAGK e PII foram purificadas por cromatografia de afinidade ou troca iônica com subsequente remoção de caudas de histidina quando aplicável. Foram realizados ensaios de interação proteína-proteína (pull-down) fotometria de massas, cinética enzimática e cromatografia por exclusão de tamanho para elucidar o estado oligomérico e possíveis complexos formados. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos de efetores como ATP e 2-oxoglutarato, bem como a sensibilidade à arginina. Os resultados sugerem que a presença da cauda de histidina na porção N-terminal de AbNAGK influencia sua oligomerização, favorecendo a formação de dímeros e alterando a sensibilidade à arginina, em contraste com a enzima nativa que mantém o estado hexamérico típico. As proteínas PII interagem com AbNAGK nativa de forma dependente de efetores, sugerindo um mecanismo de regulação fino em resposta ao estado nitrogenado celular. A análise cinética de NAGK-his indicou valores de Km e kcat acima dos reportados para NAGKs bacterianas, indicando mal funcionamento da enzima nas condições testadas. Desse modo, a partir dos resultados observados, conclui-se que a AbNAGK precisa de sua região N terminal livre para adotar a conformação hexamérica, condição necessária para a interação com as proteínas PII, observadas aqui na presença do efetor ATP, e para a função catalítica da enzima; Abstract: The alpha-proteobacterium Azospirillum brasilense is widely studied and has economic relevance due to its ability to promote plant growth through biological nitrogen fixation and the production of phytohormones. Among the pathways involved in the fate of fixed nitrogen, arginine biosynthesis stands out, in which N-acetyl-L-glutamate kinase (NAGK) catalyzes a regulatory step from glutamate in organisms that perform the ornithine synthesis cycle. Arginine is a key amino acid as a nitrogen source, acting as a precursor of polyamines in A. brasilense and of urea, compounds that can be transferred to the host plant during the association. In microorganisms, NAGK can occur in two structural forms: dimeric, insensitive to arginine (as in E. coli), and hexameric, arginine-sensitive (as in cyanobacteria). In the latter, regulation is mediated by PII proteins, regulatory and signal-transducing proteins, an interaction that does not occur in E. coli. In A. brasilense, however, there are no consolidated data on the interaction between PII proteins (GlnB and GlnZ) and the hexameric NAGK. Considering the relevance of this pathway, the present work aimed to characterize A. brasilense NAGK (AbNAGK) in terms of enzymatic activity, structure, and interaction with the PII proteins GlnZ and GlnB, as well as to evaluate the influence of metabolites and structural modifications on its function. To achieve these objectives, the protein was purified with a histidine tag and also in its native form, from vectors expressed in E. coli. NAGK and PII proteins were purified by affinity or ion-exchange chromatography with subsequent removal of histidine tags when applicable. Protein–protein interaction assays (pull-down), mass spectrometry, enzyme kinetics, and size-exclusion chromatography were performed to elucidate the oligomeric state and possible complexes formed. In addition, the effects of effectors such as ATP and 2-oxoglutarate were evaluated, as well as arginine sensitivity. The results suggest that the presence of the histidine tag at the N-terminal region of AbNAGK influences its oligomerization, favoring dimer formation and altering arginine sensitivity, in contrast to the native enzyme, which maintains the typical hexameric state. The PII proteins interact with native AbNAGK in an effector-dependent manner, suggesting a fine regulatory mechanism in response to the cellular nitrogen status. Kinetic analysis of His-tagged NAGK indicated Km and kcat values higher than those reported for bacterial NAGKs, pointing to malfunctioning of the enzyme under the tested conditions. Thus, based on the observed results, it can be concluded that AbNAGK requires a free N-terminal region to adopt the hexameric conformation, a condition necessary for interaction with PII proteins observed here in the presence of the effector ATP and for the catalytic function of the enzyme Orientador: Profª. Drª. Edileusa Cristina Marques Gerhardt; Banca: Edileusa Cristina Marques Gerhardt (Presidente da Banca), Luciano Fernandes Huergo e Ana Claudia Bonatto; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 22/08/2025; Inclui referências 2025-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100590 Otimização da produção de exopolissacarideos nos generos enterobacter, alcaligenes e acetobacter Resumo: Muitas cepas bacterianas produtoras de exopolissacarídeos (EPS) também sintetizam polímeros de reserva. A produção de EPS "slime" e dos polímeros de reserva glicogênio e polihidróxibutirato (PHB) das cepas isogênicas (EPS+ e EPS-) de Enterobacter aerogenes tipo 8 e Alcaligenes ATCC 31961 foram comparadas em cultivo em batelada ("batch culture"). Condições de desiquilíbrio nutricional com altas relações C:N favoreceram a síntese tanto de EPS como de polímero de reserva, e resultaram em pequena degradação posterior de glicogênio (em Enterobacter) e PHB (em Alcaligenes). Na cepa EPS+ de Enterobacter, a síntese de glicogênio foi compativelmente mais baixa do que na cepa EPS- , indicando que o substrato foi preferencialmente usado para a produção de EPS. Níveis reduzidos do substrato de carbono, no meio de cultura, resultaram em menor síntese dos polímeros de reserva e degradação deles nas bactérias produtoras de EPS. Considerável diferenças na síntese e quebra do carboidrato intracelular foram observadas entre as bactérias crescidas em meio sintético com sulfato de amônio e as mesmas bactérias crescidas em meio com caseína hidrolizada, como fonte de nitrogênio. O crescimento em meio com magnésio reduzido foi menor que no meio completo, em ambos os gêneros, todavia foram obtidos altos rendimentos de glicogênio tanto na cepa Enterobacter EPS+ como na EPS-. A cepa de Alcaligenes EPS+ não teve aumento no acúmulo de PHB, com redução do magnésio, mas alcançou seu melhor rendimento na produção de EPS. Uma cepa bacteriana com propriedades morfológicas e bioquímicas aproximadas ao Acetobater xylinum foi cultivada em meio não agitado, baseado em sacarose invertida e água de levedura para a produção de películas celulósicas flutuantes, lisas e espessas. O conteúdo de celulose (> 90% do peso seco, dependendo da eficiência na lavagem com água) e a natureza 0- Z>-homopoliglucana das películas foram estimadas por métodos físicos, químicos e enzimáticos. xxviiiCafeína e xantinas relacionadas foram identificadas como potentes estimuladores para a produção de celulose em Acetobacter xylinum. Estes compostos estão presentes em várias plantas cujas infusões vegetais são úteis como suplementos para os meios de cultura para esta acetobactéria. O alvo proposto para estas substâncias nativas inibitórias semelhantes à purina é a fosfodiesterase diguanil nucleotídeo, que participa no complexo celulogênico bacteriano. Um melhor entendimento desta característica da fisiologia de Acetobacter xylinum pode facilitar a preparação de películas celulósicas bacterianas, que estão sendo aplicadas como uma ferramenta biotecnológica no tratamento de queimaduras da pele e outras injúrias dérmicas; Abstract: Many exopolysaccharides (EPS)-producing bacterial strains also synthesize storage polymers. The production of slime EPS and of the storage polymers glycogen and polyhydroxybutyrate (PHB) were compared in batch cultures of EPS+ and EPS- isogenic strains of Enterobacter aerogenes type 8 and Alcaligenes sp (ATCC 31961). Conditions of nutrient imbalance with high C:N ratios favoured both EPS and storage polymer synthesis and resulted in little subsequent degradation of glycogen (in Enterobacter) and PHB (in Alcaligenes). Glycogen synthesis was consistently lower in the EPS+ than in EPSEnterobacter strain, indicating that substrate was preferentially used for EPS production. Reduced leveis of carbon substrate, in the growth médium, resulted in lower storage polymers synthesis and degradation of them in EPS-producing bactéria. Considerable differences in the synthesis and breakdown of intracellular carbohydrate were observed comparing bactéria grown in synthetic media with ammonium sulfate and the same bactéria grown in medium with casein hydrolysate, as nitrogen source. Growth in media depleted in magnesium was slower than in complete media, in both genera, but high yields of glycogen were obtained either with the EPS+ or EPS- Enterobacter strains. Alcaligenes EPS+ strain did not have increase in PHB accumulation, with magnesium depletion, but reached its better yield in EPS production. A bacterial strain with morphological and biochemical properties ciose to Acetobacter xylinum has been cultured in nonagitated, inverted sucrose- and yeast water-based medium for the production of thick, smooth, and floating cellulosic pellicles. The cellulose content (> 90% dry weight, depending on the efficiency of water washing) and the p-D-homopolyglucan nature of these pellicles were assessed by physical, Chemical, and enzymatic methods. Caffeine and related xanthines were identified as potent stimulators for bacterial cellulose production in Acetobacter xylinum. These compounds are present in several plants xxviwhose infusions are useful as culture-medium supplements for this acetobacterium. The proposed target for these native purine-like inhibitory substances is the novel diguanyl nucleotide phosphodiesterase(s) that participate(s) in the bacterial cellulogenic complex. A better understanding of this feature of A. xylinum physiology may facilitate the preparation of bacterial cellulose pellicles, which are being applied as a biotechnological tool in the treatment of skin burns and other dermal injuries Orientador: Jose Domingos Fontana; Co-orientador: Ian W.Sutherland; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Parana, Setor de Ciencias Biologicas 1994-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100588 Galactoxiloglucana de sementes de Hymenaea courbaril : estrutura, modificações e propriedades Resumo: Após a purificação do polissacarídeo bruto de Hymenaea courbaril, por resina de DEAE celulose na forma cloreto, obteve-se na fração aquosa uma galactoxiloglucana com relação molar 1,0:2,8:3,4, respectivamente, para as unidades de Gal:Xyl:Glc. No método alternativo de purificação por complexação com o reativo de Fehling, seguida de filtração em membrana a relação foi a mesma. Pela interação dos polímeros com a matriz de DEAE celulose não foi possível a separação e obtenção de galactomanana. Os estudos de 13C RMN, metilação e tratamento com enzima (3-galactosidase confirmaram a mesma estrutura para a galactoxiloglucana obtida por SOUZA LIMA, 1997, onde existem algumas unidades de 0-D-galactose ligadas ao C-4 das unidades de P-D-glucose da cadeia principal. Os experimentos de interação do tetraborato de sódio com a galactoxiloglucana purificada por filtração demonstraram que houve aumento da viscosidade após a adição do boro e que esse material apresenta comportamento de gel fraco, com um aumento do caráter elástico correspondendo ao aumento do pH. O espectro de 13C RMN do complexo mostra pela diminuição dos sinais, interação do borato com as hidroxilas do C-6 da P-D-Galp (d), C-2 (a, b ou c), C-3 (b ou c) C-4 (a, b ou c) e C-5 (c) de a-D-Xyl/?, C-3 de (3-D-Glçp (c ou d) originando, em algumas dessas posições, menor mobilidade. Esse complexo, futuramente, poderá auxiliar na elucidação do arranjo conformacional do biopolímero. Após o processo de sulfatação da galactoxiloglucana obteve-se um derivado (DS = 1,0) com atividade anticoagulante, determinada pelo método do APTT, de 44 % quando comparado a um padrão de heparina contendo 183 Ul/mg. A posição dos grupamentos sulfato feita parcialmente por análise de 13 C RMN indicou substituição em C-2 e C-3 de xilose, C-2 e C-3 da glucose e C-6 das unidades de galactose. O heparinóide aplicado em uma coluna de agarose AT- III originou duas frações, uma com baixa afinidade, e outra, com alta afinidade pela proteína, eluída somente com aumento da força iônica. Pelo teste do APTT ambas apresentaram atividade anticoagulante sendo que a com alta afinidade apresentou uma resposta correspondente a 60,1 %, e a outra fração apresentou uma atividade de 67,8 % em relação à heparina. Isso sugere que a galactoxiloglucana sulfatada age no mecanismo da coagulação sanguínea por duas vias distintas, ou seja, por interação com a antitrombina III ou com o cofator II da heparina Orientadora: Maria Rita Sierakowski; Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Parana 1999-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100546 Ação anticoagulante de polissacarídeos modificados através de reações de sulfatação Resumo: Duas galactoglucomananas extraídas dos liquens Cladonia ibitipocae e Cladonia connexa apresentando uma relação molar de Gal:Glc:Man de 35:2:60 e 38:5:55, respectivamente, foram derivatizadas por sulfatação com a finalidade de tentar estabelecer a ação anticoagulante desses derivados. Com o objetivo de produzir moléculas com alto conteúdo em sulfato, foram realizadas cinco suffatações seqüenciais para cada galactoglucomanana. Os derivados sulfatados de C. ibitipocae foram denominados de S1, S2, S3, S4 e S5 e os de C. connexa foram denominados de S1a, S2a, S3a, S4a e S5a, conforme o número de sulfatações ao qual foram submetidos e apresentaram os seguintes graus de substituição (D.S.): 0,20; 0,51; 0,87; 1,08; 1,29 e 0,24; 0,50; 0,98; 1,21; 1,54, respectivamente. Verificou-se que a substituição nas hidroxilas pelos grupos sulfato ocorre preferencialmente em C-6 em ambos os polímeros, conforme demonstrado por estudos de RMN 13C, onde se observa o desaparecimento dos sinais de C-6 livre (ô 62-63 ppm) à medida que ocorre a sulfatação e surgimento de um sinal em tomo de ô 69 ppm referente ao C-6 substituído. A análise realizada por cromatografia de exclusão estérica de alta pressão (HPSEC), demonstrou que os derivados sulfatados de ambas as galactoglucomananas são heterogêneos e constituídos por uma família de galactoglucomananas com massas molares diferenciadas. As análises de atividade anticoagulante foram realizadas através dos testes TT e APTT utilizando um pool de plasma humano normal, onde os resultados obtidos foram relacionados com os de uma heparina padrão (142 Ul/mg). Os derivados sulfatados S5 (D.S. 1,29) da galactoglucomanana de C. ibitipocae e S4a (D.S. 1,21) de C. connexa apresentaram uma ação anticoagulante máxima em uma concentração de 25 e 30 jig/mL de plasma para o teste APTT e TT, respectivamente Orientador: Marcello Iacomini; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná 2001-01-01T00:00:00Z