https://hdl.handle.net/1884/39617 2026-06-10T06:05:49Z https://hdl.handle.net/1884/100529 Clonagem, isolamento e caracterização do gene recA de Herbaspirillum seropedicae estirpe z78 Resumo: A partir de um banco genômico de Herbaspirillum seropedicae estirpe Z78, construído no cosmídeo vetor pLAFR3, foi isolado um gene análogo ao recA por complementação interespecífica da estirpe mutante Escherichia coli HB101 (recA). Seis plasmídeos recombinantes "pLAFR3::DNA de H. seropedicae Z78" foram isolados e passaram a constituir a série pBMR1 a pBMR6. O plasmídeo pBMR5 foi escolhido para estudos mais detalhados. Resultados quantitativos de sobrevivência mostraram que este plasmídeo foi capaz de conferir resistência à radiação ultravioleta e ao metanosulfonato de metila (MMS) à estirpe E. coli HB101. Além disto, o plasmídeo pBMR5 restaurou a proficiência de recombinação homóloga após conjugação de E. coli HB101. Estudos de hibridização DNA/DNA revelaram a existência de homologia estrutural entre o gene recA de E. coli K12 e o gene recA de H. seropedicae Z78 contido no plasmídeo pBMR5. O DNA inserto deste plasmídeo apresentou sítios de restrição para as enzimas BamHI, BglII, EcoRI e HindIII. O fragmento HindIII de 3,65 kb que continha o gene recA de H. seropedicae Z78 foi subclonado no vetor pTZ18R dando origem ao plasmídeo pBMR503. Este plasmídeo conferiu à E. coli HB101 níveis de complementação fisiológica iguais àqueles obtidos para pBMR5. Um derivado recA? do plasmídeo pBMR5 foi obtido por inserção do transposon Tn5. Este plasmídeo, denominado pBMR26.2, foi incapaz de restaurar a proficiência de recombinação ou de conferir resistência à radiação ultravioleta ou ao MMS às estirpes HB101 e DH5 de E. coli. Os dados obtidos neste trabalho sugerem fortemente a existência de um gene tipo recA em H. seropedicae Z78, bem como a funcionalidade de um sistema de reparo e recombinação análogo ao Sistema SOS de E. coli. Orientadores: Fabio de Oliveira Pedrosa e Liu Un Rigo; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Parana. Setor de Ciencias Biologicas 1994-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100591 Clonagem, caracterização e sequenciamento dos genes nifA e nifB de Herbaspirillum seropedicae A partir de um banco de genes de Herbaspirillum seropedicae construído no cosmídeo vetor pVK102 foi isolado o gene nifA daquele organismo por complementação do mutante FP10 nifA de Azospirillum brasilense. O plasmídeo recombinante pEMS1, contendo o gene nifA de H. seropedicae, foi identificado e caracterizado. Este plasmídeo não complementou os mutantes FP8 e FP9 (ntrC), FP3 (nifHDK) e FP6 (deficiente na produção de proteína MoFe). O fragmento Sal I de 2,0 kb do plasmídeo pEMS1 hibridizou fortemente com o gene nifA de Klebsiella pneumoniae, mas não com os genes nifHDK de A. brasilense. A região que continha o gene nifA de H. seropedicae foi mapeada numa extensão de aproximadamente 2,0 kb do plasmídeo pEMS1 por subclonagem e por hibridização. Nesta região e em suas adjacências foi demonstrado, após sequenciamento, a presença de uma ORF homóloga aos genes nifA de outros organismos e de uma ORF parcial correspondente ao gene nifB de H. seropedicae. A proteína NifA de H. seropedicae deduzida a partir da sequência de nucleotídeos possui alta homologia com outras proteínas NifA nos domínio D e E. Foi identificado ainda um interdomínio homólogo àquele presente nas proteínas NifA de Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium spp., Azorhizobium caulinodans. Sítios de ligação para NtrC e NifA e promotores -24/-12 foram identificados na região promotora do gene nifA de H. seropedicae. Após o gene nifA foi identificado também o gene nifB de H. seropedicae. A região N-terminal da proteína NifB de H. seropedicae possui alta homologia com as de B. japonicum e Azotobacter vinelandii. Dois sítios de ligação para NifA e um promotor -24/-12 foram identificados na região promotora do gene nifB de H. seropedicae. Com base nos dados da sequência de nucleotídeos dos gene nifA e nifB de H. seropedicae e nos resultados de fusões nifA::lacZ foi construído um modelo hipotético para a regulação da fixação de nitrogênio em H. seropedicae Orientadores: Fabio de Oliveira Pedrosa, Shigehiro Funayama; Contem 21 fots. coladas; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Parana, Setor de Ciencias Biologicas 1990-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/102115 Modificações químicas de polissacarídeos sulfatados de Ulva fasciata, U. laetevirens e Gayralia brasiliensis : fosforilação, metacrilação, atividade anticoagulante, propriedades físico-químicas e macromoleculares Resumo: Macroalgas verdes pertencentes ao gênero Ulva constituem uma fonte renovável para a obtenção de compostos bioativos. Dentre esses compostos, merecem destaque os polissacarídeos sulfatados conhecidos como ulvanas. Ulvanas F. UF e ULT caracterizadas no presente trabalho apresentaram como principal componente o um dissacarídeo composto por unidades de ulvanobíose constituída de unidades de a-L-ramnosep 3-sulfato e B-D-xilosep respectivamente. O enfoque central deste estudo está na produção de produtos fosforilados com diferentes massas molares, a partir das ulvanas de Ulva fasciata, por meio de reações de fosforilação química. Os produtos resultantes, antes e depois da fosforilação química, foram submetidos a análises químicas e espectroscópicas, bem como avaliados em relação às suas atividades anticoagulantes, propriedades físico-químicas e macromoleculares. Foi possível obter ulvanas com diversos níveis de fosfatação, alcançando um teor máximo de fosfato de 1,3% através da fosforilação em meio aquoso. Já para a fosforilação em meio orgânico, o teor máximo de fosfato obtido foi de 2,6%. Adicionalmente, realizou-se a reação de metacrilação, onde as frações UFM e GBM apresentaram graus de substituição de 0,3 e 0,5, respectivamente. Atividade anticoagulante das ulvanas e seus derivados quimicamente modificados foi examinada in vitro, por meio de análises do tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT) e do tempo de protrombina (PT). Ulvanas fosforiladas em meio aquoso exibiram uma atividade anticoagulante superior em comparação com as ulvanas nativas, e essa atividade foi mais pronunciada do que a observada para ulvanas fosforiladas em meio orgânico. As características macromoleculares das ulvanas e de seus produtos fosforilados em solução foram investigadas utilizando técnicas como cromatografia de exclusão de tamanho (HPSEC) e dicroísmo circular (CD). Os produtos fosforilados e metacrilados demonstraram alterações macromoleculares e conformacionais no polissacarídeo, decorrentes das modificações químicas aplicadas. Tanto as ulvanas nativas quanto seus derivados fosforilados e metacrilados representaram uma classe inédita de moléculas com potencial aplicação em diferentes áreas biotecnológicas.; Abstract: Green macroalgae belonging to the Ulva genus constitute a renewable source for obtaining bioactive compounds. Among these compounds, sulfated polysaccharides known as ulvanas stand out. Ulvanas F. UF and ULT characterized in this work presented as the main component a disaccharide composed of ulvanobiose units consisting of units of a-L-rhamnosep 3-sulfate and B-D-xylosep respectively. The central focus of this study lies in the production of phosphorylated products with different molecular weights from Ulva fasciata ulvans through chemical phosphorylation reactions. The resulting products, before and after chemical phosphorylation, underwent chemical and spectroscopic analyses and were evaluated for their anticoagulant activities, physicochemical properties, and macromolecular characteristics. Ulvans with varying degrees of phosphorylation were obtained, reaching a maximum phosphate content of 1.3% through aqueous phosphorylation. In contrast, the maximum phosphate content achieved through organic phosphorylation was 2.6%. Additionally, a methacrylation reaction was conducted, with UFM and GBM fractions having substitution degrees of 0.3 and 0.5, respectively. The anticoagulant activity of ulvans and their chemically modified derivatives was examined in vitro through activated partial thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (PT) analyses. Aqueously phosphorylated ulvans exhibited higher anticoagulant activity compared to native ulvans, and this activity was more pronounced than that observed for organically phosphorylated ulvans. The macromolecular characteristics of ulvans and their phosphorylated products in solution were investigated using techniques such as size-exclusion chromatography (HPSEC) and circular dichroism (CD). The phosphorylated and methacrylated products showed macromolecular and conformational changes in the polysaccharide resulting from the applied chemical modifications. Both native ulvans and their phosphorylated and methacrylated derivatives represent a novel class of molecules with potential applications in various biotechnological fields. Orientadora: Profa. Dra. Maria E. Duarte Noseda; Coorientador: Prof. Dr. Miguel Daniel Noseda; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 26/09/2023; Inclui referências 2023-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/99100 Caracterização funcional dos produtos dos genes Hsero_3507 e Hsero_3508 pertencentes a sistemas de dois componentes em Herbaspirillum seropedicae SmR1 Resumo: Os organismos vivos alteram a expressão de seus genes em resposta a modificações ambientais por meio de mecanismos que incluem sistemas de transdução de sinais. Um número significativo de proteínas desses sistemas não estão caracterizadas, o que aumenta a lacuna da nossa compreensão sobre função e mecanismos de sinalização ainda não conhecidos em microrganismos não modelo, como Herbaspirillum seropedicae. H. seropedicae um microrganismo de relevância à agricultura, como promotora de crescimento vegetal de diversas culturas importantes do ponto de vista econômico como, arroz, milho, cana de açúcar e sorgo. Estudos genômicos revelaram um potencial sistema de dois componentes contendo a histidina quinase Hsero_3508 e o regulador de resposta Hsero_3507. Análises do transcriptoma de H. seropedicae relataram a co-expressão dos genes Hsero_3507 e Hsero_3508 em variadas condições de crescimento, inclusive durante a interação planta-bactéria. Neste contexto, este estudo teve o objetivo de caracterizar funcionalmente os produtos dos genes Hsero_3507 e Hsero_3508 em H. seropedicae SmR1. Análises in silico revelaram que Hsero_3507 possui um domínio REC solitário, enquanto Hsero_3508 apresenta domínios sensoriais (BaeS e RbsRD) e catalíticos (HATPase_c). Ensaios de expressão em E. coli BL21(DE3) confirmaram a produção das proteínas, purificadas por cromatografia de afinidade. A interação direta entre Hsero_3507 e Hsero_3508 não foi detectada in vitro por ensaios pull down, sugerindo dependência de condições específicas. Experimentos com extratos celulares de H. seropedicae identificaram parceiros de interação para Hsero_3507, incluindo a fosfatase CheZ (quimiotaxia) e proteínas de estresse geral e transporte de nitrato, indicando seu papel na regulação de processos adaptativos. Ensaios de atividade nitrogenase demonstraram que as estirpes mutantes Hsero_3507Tn e Hsero_3508Tn mantêm capacidade de fixação de N2 não sendo essenciais para a fixação biológica do nitrogênio nesse microrganismo, no entanto, alterações fenotípicas sugerem envolvimento em motilidade e resposta ao estresse. Resultados de ensaios de [Beta]-galactosidase verificaram que a expressão do promotor do gene Hsero_3507 e Hsero_3508 em H. seropedicae SmR1 são ativados em condição de limitação de nitrogênio no meio de cultivo. Conclui-se que Hsero_3507 possa atuar como integrador de sinais ambientais, modulando respostas póstraducionais, enquanto Hsero_3508 possa funcionar como sensor de estresse ambiental; Abstract: Living organisms alter their gene expression in response to environmental changes through mechanisms that include signal transduction systems. A significant number of proteins from these systems remain uncharacterized, widening our understanding of the function and signaling mechanisms still unknown in non-model microorganisms, such as Herbaspirillum seropedicae. H. seropedicae is a microorganism of agricultural relevance, promoting plant growth in several economically important crops, such as rice, corn, sugarcane, and sorghum. Genomic studies have revealed a potential two-component system containing the histidine kinase Hsero_3508 and the response regulator Hsero_3507. Transcriptome analyses of H. seropedicae reported the coexpression of the Hsero_3507 and Hsero_3508 genes under various growth conditions, including during plant-bacteria interactions. In this context, this study aimed to functionally characterize the products of the Hsero_3507 and Hsero_3508 genes in H. seropedicae SmR1. In silico analyses revealed that Hsero_3507 possesses a solitary REC domain, while Hsero_3508 presents sensory (BaeS and RbsRD) and catalytic (HATPase_c) domains. Expression assays in E. coli BL21(DE3) confirmed the production of the proteins, which were purified by affinity chromatography. Direct interaction between Hsero_3507 and Hsero_3508 was not detected in vitro by pull-down assays, suggesting dependence on specific conditions. Experiments with H. seropedicae cell extracts identified interacting partners for Hsero_3507, including the phosphatase CheZ (chemotaxis) and general stress and nitrate transport proteins, indicating its role in the regulation of adaptive processes. Nitrogenase activity assays demonstrated that the mutant strains Hsero_3507Tn and Hsero_3508Tn maintain N2 fixation capacity, although they are not essential for biological nitrogen fixation in this microorganism. However, phenotypic alterations suggest involvement in motility and stress response. Results of [Beta]-galactosidase assays verified that the expression of the Hsero_3507 and Hsero_3508 gene promoters in H. seropedicae SmR1 are activated under nitrogen-limited conditions in the culture medium. We conclude that Hsero_3507 may act as an integrator of environmental signals, modulating post-translational responses, while Hsero_3508 may function as an environmental stress sensor Orientadora: Profª. Drª Rose Adele Monteiro; Coorientadores: Profª Drª. Edileusa Cristina Marques Gerhardt, Coorientador: Dr. Adriano Alves Stefanello; Banca: Rose Adele Monteiro (Presidente da Banca), Luciando Fernandes Huergo, Marco Aurelio Schüler de Oliveira e Ana Claudia Bonato; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 30/07/2025; Inclui referências 2025-01-01T00:00:00Z