https://hdl.handle.net/1884/39616 2026-04-04T21:56:44Z https://hdl.handle.net/1884/98636 Caracterização da enzima N-acetil-L-glutamatoquinase (NAGK) e sua possível interação com as proteínas PII (GlnZ e GlnB) em Azospirillum brasilense Resumo: A alfa-proteobactéria Azospirillum brasilense é amplamente estudada e possui relevância econômica devido à sua capacidade de promover o crescimento vegetal por meio da fixação biológica de nitrogênio e da produção de fitormônios. Entre as vias envolvidas no destino do nitrogênio fixado, destaca-se a biossíntese de arginina, na qual a N-acetil-L-glutamato quinase (NAGK) catalisa uma etapa regulatória a partir do glutamato em organismos que realizam o ciclo de síntese de ornitina. A arginina é um aminoácido-chave como fonte de nitrogênio, atuando como precursora de poliaminas em A. brasilense e da ureia, compostos que podem ser transferidos à planta hospedeira durante a associação. Em microrganismos, a NAGK pode apresentar duas formas estruturais: dimérica, insensível à arginina (como em E. coli), e hexamérica, sensível à arginina (como em cianobactérias). Nessa última, a regulação é mediada por proteínas PII, reguladoras e transdutoras de sinal, interação que não ocorre em E. coli. Em A. brasilense, entretanto, não há dados consolidados sobre a interação entre as PII (GlnB e GlnZ) e a NAGK hexamérica. Considerando a relevância dessa via, o presente trabalho buscou caracterizar a NAGK de A. brasilense (AbNAGK) quanto à atividade enzimática, estrutura e interação com as proteínas PII GlnZ e GlnB, além de avaliar a influência de metabólitos e modificações estruturais sobre sua função. Para atingir esses objetivos, a proteína foi purificada com cauda de histidina e também em sua forma nativa, a partir de vetores de produzidos em E. coli. As proteínas NAGK e PII foram purificadas por cromatografia de afinidade ou troca iônica com subsequente remoção de caudas de histidina quando aplicável. Foram realizados ensaios de interação proteína-proteína (pull-down) fotometria de massas, cinética enzimática e cromatografia por exclusão de tamanho para elucidar o estado oligomérico e possíveis complexos formados. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos de efetores como ATP e 2-oxoglutarato, bem como a sensibilidade à arginina. Os resultados sugerem que a presença da cauda de histidina na porção N-terminal de AbNAGK influencia sua oligomerização, favorecendo a formação de dímeros e alterando a sensibilidade à arginina, em contraste com a enzima nativa que mantém o estado hexamérico típico. As proteínas PII interagem com AbNAGK nativa de forma dependente de efetores, sugerindo um mecanismo de regulação fino em resposta ao estado nitrogenado celular. A análise cinética de NAGK-his indicou valores de Km e kcat acima dos reportados para NAGKs bacterianas, indicando mal funcionamento da enzima nas condições testadas. Desse modo, a partir dos resultados observados, conclui-se que a AbNAGK precisa de sua região N terminal livre para adotar a conformação hexamérica, condição necessária para a interação com as proteínas PII, observadas aqui na presença do efetor ATP, e para a função catalítica da enzima; Abstract: The alpha-proteobacterium Azospirillum brasilense is widely studied and has economic relevance due to its ability to promote plant growth through biological nitrogen fixation and the production of phytohormones. Among the pathways involved in the fate of fixed nitrogen, arginine biosynthesis stands out, in which N-acetyl-L-glutamate kinase (NAGK) catalyzes a regulatory step from glutamate in organisms that perform the ornithine synthesis cycle. Arginine is a key amino acid as a nitrogen source, acting as a precursor of polyamines in A. brasilense and of urea, compounds that can be transferred to the host plant during the association. In microorganisms, NAGK can occur in two structural forms: dimeric, insensitive to arginine (as in E. coli), and hexameric, arginine-sensitive (as in cyanobacteria). In the latter, regulation is mediated by PII proteins, regulatory and signal-transducing proteins, an interaction that does not occur in E. coli. In A. brasilense, however, there are no consolidated data on the interaction between PII proteins (GlnB and GlnZ) and the hexameric NAGK. Considering the relevance of this pathway, the present work aimed to characterize A. brasilense NAGK (AbNAGK) in terms of enzymatic activity, structure, and interaction with the PII proteins GlnZ and GlnB, as well as to evaluate the influence of metabolites and structural modifications on its function. To achieve these objectives, the protein was purified with a histidine tag and also in its native form, from vectors expressed in E. coli. NAGK and PII proteins were purified by affinity or ion-exchange chromatography with subsequent removal of histidine tags when applicable. Protein–protein interaction assays (pull-down), mass spectrometry, enzyme kinetics, and size-exclusion chromatography were performed to elucidate the oligomeric state and possible complexes formed. In addition, the effects of effectors such as ATP and 2-oxoglutarate were evaluated, as well as arginine sensitivity. The results suggest that the presence of the histidine tag at the N-terminal region of AbNAGK influences its oligomerization, favoring dimer formation and altering arginine sensitivity, in contrast to the native enzyme, which maintains the typical hexameric state. The PII proteins interact with native AbNAGK in an effector-dependent manner, suggesting a fine regulatory mechanism in response to the cellular nitrogen status. Kinetic analysis of His-tagged NAGK indicated Km and kcat values higher than those reported for bacterial NAGKs, pointing to malfunctioning of the enzyme under the tested conditions. Thus, based on the observed results, it can be concluded that AbNAGK requires a free N-terminal region to adopt the hexameric conformation, a condition necessary for interaction with PII proteins observed here in the presence of the effector ATP and for the catalytic function of the enzyme Orientador: Profª. Drª. Edileusa Cristina Marques Gerhardt; Banca: Edileusa Cristina Marques Gerhardt (Presidente da Banca), Luciano Fernandes Huergo e Ana Claudia Bonatto; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 22/08/2025; Inclui referências 2025-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/99100 Caracterização funcional dos produtos dos genes Hsero_3507 e Hsero_3508 pertencentes a sistemas de dois componentes em Herbaspirillum seropedicae SmR1 Resumo: Os organismos vivos alteram a expressão de seus genes em resposta a modificações ambientais por meio de mecanismos que incluem sistemas de transdução de sinais. Um número significativo de proteínas desses sistemas não estão caracterizadas, o que aumenta a lacuna da nossa compreensão sobre função e mecanismos de sinalização ainda não conhecidos em microrganismos não modelo, como Herbaspirillum seropedicae. H. seropedicae um microrganismo de relevância à agricultura, como promotora de crescimento vegetal de diversas culturas importantes do ponto de vista econômico como, arroz, milho, cana de açúcar e sorgo. Estudos genômicos revelaram um potencial sistema de dois componentes contendo a histidina quinase Hsero_3508 e o regulador de resposta Hsero_3507. Análises do transcriptoma de H. seropedicae relataram a co-expressão dos genes Hsero_3507 e Hsero_3508 em variadas condições de crescimento, inclusive durante a interação planta-bactéria. Neste contexto, este estudo teve o objetivo de caracterizar funcionalmente os produtos dos genes Hsero_3507 e Hsero_3508 em H. seropedicae SmR1. Análises in silico revelaram que Hsero_3507 possui um domínio REC solitário, enquanto Hsero_3508 apresenta domínios sensoriais (BaeS e RbsRD) e catalíticos (HATPase_c). Ensaios de expressão em E. coli BL21(DE3) confirmaram a produção das proteínas, purificadas por cromatografia de afinidade. A interação direta entre Hsero_3507 e Hsero_3508 não foi detectada in vitro por ensaios pull down, sugerindo dependência de condições específicas. Experimentos com extratos celulares de H. seropedicae identificaram parceiros de interação para Hsero_3507, incluindo a fosfatase CheZ (quimiotaxia) e proteínas de estresse geral e transporte de nitrato, indicando seu papel na regulação de processos adaptativos. Ensaios de atividade nitrogenase demonstraram que as estirpes mutantes Hsero_3507Tn e Hsero_3508Tn mantêm capacidade de fixação de N2 não sendo essenciais para a fixação biológica do nitrogênio nesse microrganismo, no entanto, alterações fenotípicas sugerem envolvimento em motilidade e resposta ao estresse. Resultados de ensaios de [Beta]-galactosidase verificaram que a expressão do promotor do gene Hsero_3507 e Hsero_3508 em H. seropedicae SmR1 são ativados em condição de limitação de nitrogênio no meio de cultivo. Conclui-se que Hsero_3507 possa atuar como integrador de sinais ambientais, modulando respostas póstraducionais, enquanto Hsero_3508 possa funcionar como sensor de estresse ambiental; Abstract: Living organisms alter their gene expression in response to environmental changes through mechanisms that include signal transduction systems. A significant number of proteins from these systems remain uncharacterized, widening our understanding of the function and signaling mechanisms still unknown in non-model microorganisms, such as Herbaspirillum seropedicae. H. seropedicae is a microorganism of agricultural relevance, promoting plant growth in several economically important crops, such as rice, corn, sugarcane, and sorghum. Genomic studies have revealed a potential two-component system containing the histidine kinase Hsero_3508 and the response regulator Hsero_3507. Transcriptome analyses of H. seropedicae reported the coexpression of the Hsero_3507 and Hsero_3508 genes under various growth conditions, including during plant-bacteria interactions. In this context, this study aimed to functionally characterize the products of the Hsero_3507 and Hsero_3508 genes in H. seropedicae SmR1. In silico analyses revealed that Hsero_3507 possesses a solitary REC domain, while Hsero_3508 presents sensory (BaeS and RbsRD) and catalytic (HATPase_c) domains. Expression assays in E. coli BL21(DE3) confirmed the production of the proteins, which were purified by affinity chromatography. Direct interaction between Hsero_3507 and Hsero_3508 was not detected in vitro by pull-down assays, suggesting dependence on specific conditions. Experiments with H. seropedicae cell extracts identified interacting partners for Hsero_3507, including the phosphatase CheZ (chemotaxis) and general stress and nitrate transport proteins, indicating its role in the regulation of adaptive processes. Nitrogenase activity assays demonstrated that the mutant strains Hsero_3507Tn and Hsero_3508Tn maintain N2 fixation capacity, although they are not essential for biological nitrogen fixation in this microorganism. However, phenotypic alterations suggest involvement in motility and stress response. Results of [Beta]-galactosidase assays verified that the expression of the Hsero_3507 and Hsero_3508 gene promoters in H. seropedicae SmR1 are activated under nitrogen-limited conditions in the culture medium. We conclude that Hsero_3507 may act as an integrator of environmental signals, modulating post-translational responses, while Hsero_3508 may function as an environmental stress sensor Orientadora: Profª. Drª Rose Adele Monteiro; Coorientadores: Profª Drª. Edileusa Cristina Marques Gerhardt, Coorientador: Dr. Adriano Alves Stefanello; Banca: Rose Adele Monteiro (Presidente da Banca), Luciando Fernandes Huergo, Marco Aurelio Schüler de Oliveira e Ana Claudia Bonato; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 30/07/2025; Inclui referências 2025-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100659 Avanços translacionais em polissacarídeos fúngicos : métodos de extração, purificação, caracterização estrutural, análises biológicas e estudos de aplicação de caráter terapêutico Resumo disponível somente no PDF por conter caracteres especiais, fórmulas, equações, diagramas, entre outros Orientador: Prof. Dr. Marcello Iacomini; Coorientadora: Prof. Lucimara M. C. Cordeiro; Banca: Marcello Iacomini (Presidente da Banca), Thales Ricardo Cipriani, Fhernanda Ribeiro Smiderle e Alexandra Acco; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 17/10/2025; Inclui referências 2025-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/100610 Variação somaclonal, metabolismo de carbono e caracterização bioquimica e imunologica nos cultivos celulares de Mandevilla velutina (Mart) Woodson (Apocynaceae) Resumo: Culturas de células de Mandevilla velutina em meios líquido e semi-sólido apresentaram taxas de crescimento segundo um modelo sigmoidal, com cinéticas distintas para a expressão do crescimento, como biomassa úmida e liofilizada, respectivamente. As curvas de dissimilação foram efetivas como método de análise de crescimento celular, dada a alta correlação apresentada com o peso fresco. Os clones auxotróficos quanto aos reguladores de crescimento ocorreram em maior número, porém alguns clones autótrofos foram identificados. Os fatores densidade de inóculo inicial e luz induziram a expressão da heterogeneidade genética presente nas populações. Os cultivos apresentaram ciclo mitótico assíncrono, variação morfológica elevada e agregados celulares freqüentes. Células com características embriogenéticas e cloroplastos funcionais foram observadas, indicando a expressão de funções especializadas associadas à diferenciação celular. Arabinose, fucose e ramnose não foram metabolizadas eficientemente pelos clones, enquanto glucose demonstrou uma pequena capacidade de sustentação do crescimento, sendo um fator limitante na concentração utilizada. Sintomas de toxicidez celular foram encontrados com a utilização combinada e isolada destes monossacarídeos. A biossíntese dos compostos velutinol A e MV 8612 (forma glicosilada) foi significativamente afetada pela variação nas fontes de carbono, com incrementos de 84% e 47%, respectivamente, com o uso de glucose a 3% em relação ao controle. Concentrações de MV 8612 similares ao controle foram encontradas com o uso de fucose a 3%, apesar do reduzido crescimento constatado. A utilização de hidrolases do caramujo Megalobulimus paranaguensis associada à Celluclast® viabilizou a protoplastização de 80% das células, com um período de incubação de 2 h, usando-se manitol a 0,5M como osmoticum. A composição estrutural das hemiceluloses de parede celular apresenta (3-D-glucose (20%), D-xilose (13 %) e L-ramnose (12%) como constituintes majoritários. Detectou-se ainda a presença de L-fucose (1 %), um deoxi-açúcar pouco comum em paredes celulares de vegetais superiores. Os resultados de 13C-RMN mostraram que a cadeia principal das hemiceluloses é uma P glucana, com peso molecular médio na faixa de 9900 e 13000 daltons. Células cultivadas in vitro foram imunógenos potentes por via Xintraperitoneal em camundongos. Verificou-se um aumento da especificidade de reconhecimento dos anticorpos com o avanço do processo de purificação dos anticorpos policlonais por cromatografia de troca iônica e imunoafinidade, o que indica a ocorrência de resposta restrita. A fração IgG purificada por imunoafínidade reconheceu possíveis determinantes antigênicos contendo Lfucose, os quais situam-se em áreas restritas da superfície celular. A existência de tipos celulares distintos nas populações cultivadas in vitro é inferida, devido aos gradientes de marcação de superfície celular observados por imunofluorescência indireta. As frações hemicelulósicas demonstraram distintos potenciais de antigenicidade, sendo a fração neutra da hemicelulose B (1M KOH) aquela mais intensamente reconhecida pelos anticorpos; Abstract: Mandevilla velutina cell suspension and calli cultures showed growth rate according to a sigmoid model and distinct kinetics for that parameter, as fresh and lyophilized biomass. Dissimilation curves were effective as analysis method conceming the cell growth, with a high correlation to the fresh weight. The most of the clones were auxotrofic as to growth regulators, however some autotrofíc ones were observed. The genetic heterogeneity presents in the cell population was expressed by manipulating initial inoculum density and light. An asynchronous mitotic cycle, frequent cell aggregates and several morphological types characterized the cell cultures, as well as embryogenetic cells and functional chloroplasts were found, showing the occurrence of cell differentiation. Arabinose, fucose and rhamnose were not metabolized for the clones, while glucose (3g%) was able in sustaining low growth rates, being a limiting factor. Cell cultures showed toxic symptoms as these monosaccharides were administered both in isolated or combined form. Velutinol A and MV 8612 (glicosylated form) biosynthesis was strongly affected by changing of the carbon sources, displaying increases of 84% and 47% when compared to the control, respectively, as cell cultures were fed with glucose 3g%. MV8612 concentrations similar to the control were found by using fucose 3g% as sole carbon source, in despite of the low cell growth observed. The hydrolase complex from the gastric juice of the snail Megalobulimus paranaguensis combined to Celluclast® yielded 80% of cell protoplastization, with an incubation time of 2 hours and mannitol 0.5M as osmoticum. The cell wall hemicellulose structural composition is based on P-Dglucose, L-rhamnose and D-xylose as major components, presenting also Lfucose, a less common deoxy-sugar in cell wall of higher plants. The hemicellulose backbone is a P-glucan, showing a molecular weigh range of 9,900-13,000 daltons. In vitro cultured cells were strong immunogens through intraperitoneal and subcutaneous via in mice and rabbits, respectively. Sequential ion-exchange and immunoaffínity chromatography allowed the obtainment of purified polyclonal antibodies with higher specificity along the purification steps, indicating the occurrence of restricted response in mice. The IgG fraction purified by immunoaffínity chromatography was able in recognizing antigenic xiideterminants containing L-fucose, which occur in restricted areas of the cell surface. The existence of distinct cell types is inferred due to the gradients of marking observed in the cell surface by indirect immunofluorescence reaction. Dot-blot assays revealed differences related to antigenic potential of the cell wall polysaccharides, with the neutral fraction of the hemicellulose B (KOH 1M) being stronger recognized Orientadores:Jose Domingos Fontana, Robert Verpoorte; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Parana 1998-01-01T00:00:00Z