https://hdl.handle.net/1884/39610 anterior a 2002, ver Programa de Pós-Graduação em Morfologia 2026-08-25T11:53:17Z https://hdl.handle.net/1884/107138 Fosfolipase-D do veneno de Loxosceles intermedia na modulação da biologia celular de melanoma Resumo: O câncer é um problema de saúde pública mundial, o melanoma está entre os tumores mais agressivos devido a sua capacidade de escapar da vigilância imunológica e a resistência aos tratamentos convencionais. Neste estudo, linhagens celulares de melanoma murino, B16-F1 e B16-F10, foram expostas à fosfolipase-D (FLD) recombinante proveniente do veneno da aranha Loxosceles intermedia (aranha-marrom). As FLDs representam uma família de toxinas encontradas nos venenos das aranhas do gênero Loxosceles. Tratam-se de enzimas biologicamente ativas que clivam fosfolipídios nas membranas das células-alvo e causam os sintomas do envenenamento pela picada da aranha marrom. A modulação da biologia celular tumoral foi avaliada utilizando células do grupo controle e células expostas à FLD. A ligação da toxina à superfície celular foi avaliada por microscopia de fluorescência confocal, citometria de fluxo, microscopia invertida e microscopia eletrônica de varredura. Foram conduzidos ensaios para avaliar o comportamento celular verificando citotoxicidade, capacidade de formação de colônias, proliferação e migração celular. Os dados mostram que a FLD se liga à superfície celular das linhagens estudadas e inicialmente desencadeia a produção de ectossomos, seguida pela formação de nanoclusters. Por esta razão, a concentração de cálcio intracelular e a externalização de fosfatidilserina foram avaliadas. Os tratamentos não causaram sinais de citotoxicidade, aumentaram a capacidade de formação de colônias, a proliferação e a migração celular, o cálcio intracelular e a externalização de fosfatidilserina. A exposição à FLD desencadeia ativação e sinalização celular, com formação de ectossomos e aumento da expressão de genes relacionados à proliferação e migração. Esses eventos são mais pronunciados na linhagem de melanoma mais agressiva, B16-F10. Em conjunto, os dados indicam o potencial da FLD do veneno da aranha L. intermedia como bioferramenta em estudos da biologia celular tumoral; Abstract: Cancer is a global public health problem, and melanoma is among the most aggressive tumors due to its ability to evade immune surveillance and resist conventional treatments. In this study, murine melanoma cell lines, B16-F1 and B16-F10, were exposed to recombinant phospholipase D (PLD) derived from the venom of the spider Loxosceles intermedia (brown spider). PLDs represent a family of toxins found in the venoms of spiders of the Loxosceles genus. These are biologically active enzymes that cleave phospholipids in the membranes of target cells and cause the symptoms of brown spider bite envenomation. Tumor cell biology modulation was assessed using control cells and cells exposed to PLD. Toxin binding to the cell surface was evaluated by confocal fluorescence microscopy, flow cytometry, inverted microscopy, and scanning electron microscopy. Assays were conducted to evaluate cellular behavior, assessing cytotoxicity, colony-forming ability, proliferation, and cell migration. The data show that PLD binds to the cell surface of the studied cell lines and initially triggers ectosome production, followed by nanocluster formation. For this reason, intracellular calcium concentration and phosphatidylserine externalization were evaluated. Treatments did not cause signs of cytotoxicity but increased colony forming capacity, proliferation, cell migration, intracellular calcium, and phosphatidylserine externalization. Exposure to PLD triggers cellular activation and signaling, with ectosome formation and increased expression of genes related to proliferation and migration. These events are more pronounced in the more aggressive melanoma cell line, B16-F10. Taken together, the data indicate the potential of L. intermedia spider venom PLD as a bio-tool for studies of tumor cell biology Orientador: Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga; Coorientadora: Profa. Dra. Andrea Senff Ribeiro; Banca: Silvio Sanches Veiga (Presidente da Banca), Fabiola Iagher, Francisco Filipak Neto e Andrea Senff Ribeiro; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 19/03/2026; Inclui referências; Área de concentração: Biologia Celular e Molecular 2026-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/105803 Glucuronoarabinoxilana da goma do abacaxi : potencial imunoterápico baseado na ativação de macrófagos e indução de imunidade treinada em modelo de melanoma murino Resumo: Considerando os efeitos adversos das terapias convencionais e a resposta ainda limitada às imunoterapias no tratamento do melanoma metastático, estratégias voltadas à modulação do microambiente tumoral têm adquirido crescente relevância. Em especial, aquelas que favorecem a repolarização de macrófagos associados a tumores (TAMs) em direção a fenótipos M1-like, classicamente associados a atividades pró-inflamatórias e antitumorais. Nesse contexto, polissacarídeos têm se destacado por suas propriedades imunoestimulantes e antitumorais, com destaque para a classe das arabinoxilanas (AXs). Mais recentemente, AXs também foram descritas como capazes de induzir o treinamento imune, tornando células da imunidade inata mais responsivas a estímulos secundários heterólogos, o que reforça o interesse em sua aplicação terapêutica, especialmente em doenças nas quais a imunotolerância representa um desafio. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo investigar as propriedades imunoestimulantes (in vitro e ex vivo) e antitumorais de uma glucuronoarabinoxilana (GAX) extraída da goma do abacaxi (ANPT) – um resíduo agroindustrial sem valor agregado – em modelo de melanoma murino. Os resultados demonstraram que macrófagos peritoneais derivados de animais portadores de melanoma tratados com ANPT (100 mg/kg/dia), quando reexpostos ex vivo ao polissacarídeo (1000 µg/mL, 24 h), apresentaram um aumento significativo de suas áreas e complexidade celular (p <0,0001), quando avaliadas suas morfologias. Quando avaliadas suas capacidades funcionais, essas células também apresentaram um aumento significativo na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) (66%) e na atividade fagocítica (35%). Assim como apresentaram um perfil de citocinas pró-inflamatórias pronunciado (IL-12p70, TNF, IL-6, IFN-y) e uma produção de óxido nítrico (NO) 6 vezes maior frente a estímulos pró-inflamatórios, em comparação aos macrófagos peritoneais derivados de animais do grupo controle. O tratamento dos animais portadores de melanoma com o ANPT (100 mg/kg/dia), também foi capaz de dobrar a quantidade de precursores hematopoiéticos e aumentar a expressão de marcadores clássicos de fenótipos M1-like (CD80+/CD86+) em macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs), em comparação aos BMDMs de animais do grupo controle. Essa atividade imunoestimulante foi atribuída ao reconhecimento do ANPT por receptores do tipo TLR4 em ensaios realizados com as células HEK-Blue™ hTLR4, que superexpressam tais receptores, e à ativação de vias MyD88-dependentes e não dependentes, em experimentos com BMDMs de animais saudáveis, tratados na presença ou ausência de um inibidor da proteína adaptadora MyD88. Além disso, os resultados sugerem a capacidade do ANPT em induzir o treinamento imune em BMDMs de animais saudáveis, que se tornaram significativamente mais responsivos à secreção de IL-6 e MCP-1 (p <0,01) após estímulo pró-inflamatório secundário. Em camundongos C57BL/6, o treinamento prévio com o ANPT (1 mg) inibiu significativamente o crescimento de tumores de B16-F10 (57%), de forma dependente do tratamento diário subsequente (100 mg/kg/dia) com o polissacarídeo. Esses achados evidenciam o potencial do ANPT em induzir um fenótipo M1-like em macrófagos e promover efeitos antitumorais mediados pelo treinamento imune. Essa atividade destaca o ANPT como uma alternativa promissora para o tratamento do melanoma, além de agregar valor a um resíduo agroindustrial, promovendo alternativas sustentáveis na busca por novas estratégias terapêuticas; Abstract: In light of the adverse effects associated with conventional therapies and the limited efficacy of immunotherapies in metastatic melanoma, strategies targeting the tumor microenvironment have gained increasing attention. In particular, those that promote the repolarization of tumor-associated macrophages (TAMs) toward M1-like phenotypes, which are classically associated with pro-inflammatory and antitumor activities. In this context, polysaccharides have emerged as promising molecules due to their immunostimulatory and antitumor properties, with a special emphasis on the arabinoxylan (AX) class. Recently, AXs have also been reported to induce immune training, making innate immune cells more responsive to secondary heterologous stimuli, thereby increasing interest in their therapeutic application, especially in diseases where immunotolerance represents a challenge. In this context, this study aimed to investigate the immunostimulatory (in vitro and ex vivo) and antitumor properties of a glucuronoarabinoxylan (GAX) extracted from pineapple gum (ANPT), an agro-industrial residue with no added commercial value, in a murine melanoma model. The results demonstrated that peritoneal macrophages derived from melanoma-bearing animals treated with ANPT (100 mg/kg/day), when re-exposed ex vivo to the polysaccharide (1000 µg/mL, 24 h), exhibited a significant increase in their areas and cellular complexity (p < 0.0001) when their morphologies were analyzed. When their functional capacities were evaluated, these cells also exhibited a significant increase in reactive oxygen species (ROS) production (66%) and phagocytic activity (35%). They also exhibited a pronounced pro-inflammatory cytokine profile (IL-12p70, TNF, IL-6, IFN-?), and a nitric oxide (NO) production that was sixfold higher in response to pro-inflammatory stimuli compared to peritoneal macrophages derived from control animals. When treated with ANPT (100 mg/kg/day), melanoma-bearing animals also exhibited a twofold increase in the number of hematopoietic precursors and increased expression of classic markers of M1-like phenotypes (CD80+/CD86+) in bone marrow-derived macrophages (BMDMs), compared with BMDMs from control animals. This immunostimulatory activity has been attributed to the recognition of ANPT by TLR4 receptors in assays conducted with HEK-Blue™ hTLR4 cells, which overexpress these receptors, and to the activation of MyD88-dependent and MyD88-independent pathways in experiments with BMDMs from healthy animals treated in the presence or absence of a MyD88 adaptor protein inhibitor. Furthermore, the results suggest that ANPT can induce immunity training in BMDMs from healthy animals, which became significantly more responsive to the secretion of IL-6 and MCP-1 (p < 0.01) following a secondary pro-inflammatory stimulus. In C57BL/6 mice, previous training with ANPT (1 mg) significantly inhibited the growth of B16-F10 tumors (57%, p < 0.0001), in a manner dependent on subsequent daily treatment (100 mg/kg/day) with the polysaccharide. These findings highlight the potential of ANPT to induce an M1-like phenotype in macrophages and promote antitumor effects mediated by immune priming. This activity highlights ANPT as a promising alternative for the treatment of melanoma, in addition to adding value to an agroindustrial residue, promoting sustainable alternatives in the search for new therapeutic strategies Orientadora: Profa. Dra. Fernanda Fogagnoli Simas; Coorientadora: Profa. Dra. Carolina Camargo de Oliveira; Banca: Fernanda Fogagnoli Simas (Presidente da Banca), Diego Veras Wilke e Juliano Bordignon; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2026; Inclui referências; Área de concentração: Biologia Celular e Molecular 2026-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/105552 Efeito da suplementação com óleo de peixe, rico em ácidos graxos poli-insaturados ômega-3, sobre a homeostase glicêmica e aspectos morfofuncionais do tecido ósseo em modelo animal de envelhecimento biológico Resumo: O envelhecimento populacional eleva a incidência de condições crônico degenerativas sobre o sistema esquelético, nesse sentido, a suplementação com ômega 3 pode modular a sensibilidade periférica à glicose, e refrear as alterações estruturais e metabólicas decorrentes do processo de envelhecimento nesse sistema. Este estudo teve como objetivo detectar o início da perda do controle glicêmico e rastrear o declínio da funcionalidade motora, além de avaliar a ação do ômega 3 em refrear as alterações morfofuncionais sobre os ossos nesse processo. Neste estudo, a partir da detecção da intolerância periférica à glicose aos 12 meses de idade ratos Wistar foram divididos em: (CTL) Grupo controle composto por animais que não passaram por nenhuma intervenção; (OP) Grupo de animais suplementados com óleo de peixe rico em omêga-3 (1 mg/kg) durante 8 semanas consecutivas iniciando aos 12 meses. Após o período experimental, aos 15 meses, ambos os grupos CTL e OP foram avaliados por meio do teste de tolerância a glicose (GTT), e em seguida eutanasiados, foi realizada a coleta do plasma para avaliação dos marcadores séricos da remodelação óssea, assim como os membros pélvicos para avaliação da constituição celular e histomorfometria do osso femoral por meio do software Image Pro P/tvs®. A análise estatística utilizada foi ANOVA de medidas repetidas, e quando atribuível teste t não pareado, para explorar a dispersão e relação dos resultados obtidos utilizando os softwares Graph Pad Prism® e R Studio®. Sobre o GTT foi possível verificar que o grupo de animais OP exibiram uma redução na AUC (Área sob a curva glicêmica) no teste do GTT (p<0,001) e eficiência superior na captação periférica de glicose quando comparados aos CTL aos 15 meses de idade (Figura 1A). Foi possível observar no grupo OP em relação a CTL redução na quantificação de cálcio (t=2,338, p=0,0299) fósforo (t=2,260, p=0,0346) e magnésio (t=3,307, p=0,0035) sérico, associada a menor atividade óssea reabsortivas (t=2,039, p=0,0496) determinada pela atividade enzimática da fosfatase ácida resistente ao tartarato óssea (TRAP), evidenciando possível manutenção da deposição mineral sobre os ossos no grupo OP. Também foi observada elevação do número de osteócitos da região cortical na diáfise femoral nos animais OP em relação aos CTL (t=2,448, p=0,0499), ainda que não tenha sido observada diferença sobre a densidade de osso trabecular. Os achados deste estudo permitem concluir que a suplementação oral com óleo de peixe, rico em AG n-3, foi eficaz em refrear as alterações sobre o metabolismo glicêmico, imputadas pelo envelhecimento, em exercer importante efeito sobre o metabolismo ósseo, que se reflete em preservação da morfologia tecidual e também em promover a manutenção da viabilidade celular e estabilidade da atividade remodelativa na matriz óssea. Estes resultados permitem sugerir que o emprego de suplementação com AG n-3 pode representar estratégia simples de preservação do tecido ósseo e conseqüente melhora da qualidade de vida, durante o envelhecimento biológico.; Abstract: Population aging increases the incidence of chronic degenerative conditions in the skeletal system, in this sense, supplementation with omega 3 can modulate peripheral sensitivity to glucose, and curb structural and metabolic changes resulting from the aging process in this system. This study aimed to detect the beginning of the loss of glycemic control and track the decline in motor functionality, in addition to evaluating the action of omega 3 in curbing morphofunctional changes in the bones in this process. In this study, after the detection of peripheral glucose intolerance at 12 months of age, Wistar rats were divided into: (CTL) Control group composed of animais that did not undergo any intervention; (OP) Group of animais supplemented with fish oil rich in omega-3 (1 mg/kg) for 8 consecutive weeks starting at 12 months. After the experimental period, at 15 months, both CTL and OP groups were evaluated using the glucose tolerance test (GTT), and then euthanized, plasma was collected to evaluate serum markers of bone remodeling, thus such as the pelvic limbs to evaluate the cellular constitution and histomorphometry of the femoral bone using Image Pro Plus® software. The statistical analysis used was repeated measures ANOVA, and when applicable unpaired t-test, to explore the dispersion and relationship of the results obtained using the Graph Pad Prism® and R Studio® software. Regarding the GTT, it was possible to verify that the OP group of animais exhibited a reduction in AUC (p<0.001) and superior efficiency in peripheral glucose uptake when compared to CTL at 15 months of age (Figure 1A). It was possible to observe in the OP group in relation to CTL a reduction in the quantification of calcium (t=2.338, p=0.0299), phosphorus (t=2.260, p=0.0346) and magnesium (t=3.307, p=0.0035) serum, associated with lower bone resorptive activity (t=2.039, p=0.0496) determined by the enzymatic activity of bone tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), showing possible maintenance of mineral deposition on the bones in the OP group. An increase in the number of osteocytes in the cortical region of the femoral diaphysis was also observed in OP animais compared to CTL (t=2.448, p=0.0499), although no difference was observed in trabecular bone density. The findings of this study allow us to conclude that oral supplementation with fish oil, rich in n-3 FA, was effective in curbing changes in glycemic metabolism, attributed to aging, in exerting an important effect on bone metabolism, which is reflected in preservation of tissue morphology and also in promoting the maintenance of cell viability and stability of remodeling activity in the bone matrix. These results allow us to suggest that the use of supplementation with n-3 FA may represent a simple strategy for preserving bone tissue and consequently improving quality of life during biological aging. Orientadora: Profª Drª Katya Naliwaiko; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 23/02/2024; Inclui referências; Área de concentração: Biologia Celular e Molecular 2024-01-01T00:00:00Z https://hdl.handle.net/1884/105153 Influência de polimorfismos em metaloproteinases da matriz na mucosite oral quimioinduzida em pacientes pediátricos com neoplasias hematológicas Resumo: A mucosite oral (MO) é uma complicação frequente em pacientes oncopediátricos, sendo especialmente induzida devido ao uso de agentes quimioterápicos como o metotrexato (MTX), cuja ação provoca estresse oxidativo e aumento de citocinas inflamatórias, resultando em toxicidade oral. A suscetibilidade à MO pode ser influenciada por fatores genéticos, como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em genes das metaloproteinases da matriz (MMPs), enzimas envolvidas na degradação da matriz extracelular e no reparo tecidual. Este estudo investigou a associação entre os SNPs MMP-1 g.-1607 G>GG (rs1799750), MMP-8 g.-799 C>T (rs11225395) e MMP-13 g.-77 A>G (rs2252070) com a ocorrência e a gravidade da MO em 100 pacientes oncopediátricos (5 a 19 anos) em tratamento com MTX, sendo 16 pacientes sem MO (G1) e 84 com MO (G2). A avaliação clínica da MO foi realizada pelo Oral Assessment Guide - Modificado, e a análise genotípica por PCR-RFLP. As distribuições genotípicas foram avaliadas quanto ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, sendo observada ausência de equilíbrio apenas para o SNP MMP-8 rs11225395 no G2 (p < 0,0001). Houve associação significativa entre a ocorrência de MO e os SNPs investigados. No SNP MMP-1 g.-1607 G>GG, o alelo 2G foi observado em 31,25% do G1 e 58,9% do G2 (p = 0,021; OR = 2,72; IC 95%: 1,21–6,11), e o genótipo 2G/2G teve frequência de 18,75% no G1 e 34,52% no G2 (p = 0,032; OR = 4,11; IC 95%: 1,36–12,46). No SNP MMP-8 g.-799 C>T, o alelo C foi o mais frequente em ambos os grupos, mas houve diferença significativa: 81,25% no G1 e 53% no G2 (p = 0,005; OR = 3,84; IC 95%: 1,50–9,82). O genótipo T/T apresentou frequência de 6,25% no G1 e 39,2% no G2 (p = 0,037; OR = 2,66; IC 95%: 1,85–8,33). No SNP MMP-13 g.-77 A>G, o alelo A apresentou maior frequência no G2 (76,8%) em relação ao G1 (56,25%) (p = 0,028; OR = 2,57; IC 95%: 1,17–5,64). O genótipo mais frequente no G1 foi A/G (62,5%), enquanto no G2 foi A/A (60,7%) (p = 0,031; OR = 4,63; IC 95%: 1,38–15,60). Na análise da gravidade da MO, o SNP MMP-8 g.-799 C>T apresentou associação significativa, com o alelo T mais frequente em pacientes com MO severa (67,3%) do que em pacientes com MO leve/moderada (45%), sugerindo que o alelo T eleva a gravidade da doença (p = 0,03; OR = 2,78; IC 95%: 1,18–6,54). A análise de correspondência múltipla (MCA) demonstrou que os genótipos heterozigotos dos três genes estão relacionados principalmente ao grupo com MO severa. A análise haplotípica (PHASE v2.1.1) revelou haplótipos distintos entre os grupos, sendo os mais frequentes C-1G-A no G1 e T-2G-A no G2, embora sem significância estatística. Esses achados reforçam a importância dos SNPs das MMPs como potenciais marcadores para prever a suscetibilidade e gravidade da MO, sugerindo que esses dados podem auxiliar na personalização de tratamentos e estratégias de prevenção; Abstract: Oral mucositis (OM) is a frequent complication in pediatric oncology patients, particularly induced by chemotherapeutic agents such as methotrexate (MTX), whose action causes oxidative stress and increased inflammatory cytokines, resulting in oral toxicity. Susceptibility to OM may be influenced by genetic factors, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs) in matrix metalloproteinase (MMP) genes, enzymes involved in extracellular matrix degradation and tissue repair. This study investigated the association between the SNPs MMP-1 g.-1607 G>GG (rs1799750), MMP-8 g.-799 C>T (rs11225395), and MMP-13 g.-77 A>G (rs2252070) with the occurrence and severity of OM in 100 pediatric oncology patients (5–19 years) undergoing MTX treatment, including 16 patients without OM (G1) and 84 patients with OM (G2). Clinical evaluation of OM was performed using the Modified Oral Assessment Guide, and genotyping was conducted via PCR-RFLP. Genotypic distributions were assessed for Hardy-Weinberg equilibrium, with imbalance observed only for the MMP-8 rs11225395 SNP in G2 (p < 0.0001). Significant associations were found between OM occurrence and the investigated SNPs. For MMP-1 g.-1607 G>GG, the 2G allele was observed in 31.25% of G1 and 58.9% of G2 (p = 0.021; OR = 2.72; 95% CI: 1.21–6.11), and the 2G/2G genotype was present in 18.75% of G1 and 34.52% of G2 (p = 0.032; OR = 4.11; 95% CI: 1.36–12.46). For MMP-8 g.-799 C>T, the C allele was the most frequent in both groups, but a significant difference was observed: 81.25% in G1 versus 53% in G2 (p = 0.005; OR = 3.84; 95% CI: 1.50–9.82). The T/T genotype was found in 6.25% of G1 and 39.2% of G2 (p = 0.037; OR = 2.66; 95% CI: 1.85–8.33). For MMP-13 g.-77 A>G, the A allele was more frequent in G2 (76.8%) compared to G1 (56.25%) (p = 0.028; OR = 2.57; 95% CI: 1.17–5.64). The most frequent genotype in G1 was A/G (62.5%), while in G2 it was A/A (60.7%) (p = 0.031; OR = 4.63; 95% CI: 1.38–15.60). Regarding OM severity, the MMP-8 g.-799 C>T SNP showed a significant association, with the T allele being more frequent in patients with severe OM (67.3%) than in those with mild/moderate OM (45%), suggesting that the T allele increases disease severity (p = 0.03; OR = 2.78; 95% CI: 1.18–6.54). Multiple correspondence analysis (MCA) demonstrated that the heterozygous genotypes of the three genes were mainly associated with the severe OM group. Haplotype analysis (PHASE v2.1.1) revealed distinct haplotypes between groups, with C-1G-A being the most frequent in G1 and T-2G-A in G2, although without statistical significance. These findings reinforce the importance of MMP SNPs as potential markers for predicting susceptibility and severity of OM, suggesting that these data could help guide personalized treatments and preventive strategies Orientadora: Profa. Dra. Maria Cristina Leme Godoy dos Santos; Banca: Maria Cristina Leme Godoy dos Santos (Presidente da Banca), Dalila Luciola Zanette e Luiza Helena Gremski; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/03/2026; Inclui referências; Área de concentração: Biologia Celular e Molecular 2026-01-01T00:00:00Z