40001016044P0 Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia

Estudo dos mecanismos envolvidos na permeabilidade vascular relacionada à toxicidade urêmica

2026-05-05T13:35:19Z

Estudo dos mecanismos envolvidos na permeabilidade vascular relacionada à toxicidade urêmica Resumo: A disfunção endotelial é frequente em pacientes com doença renal crônica (DRC) e pode resultar na perda de junções intercelulares e assim contribuir para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCV). O objetivo do presente estudo foi investigar in vivo e in vitro o impacto do ambiente urêmico na permeabilidade vascular. Para tanto, foram coletados soros de 80 pacientes em diferentes estágios de DRC. Foram dosados os níveis séricos das toxinas urêmicas p-cresil sulfato (PCS), indoxil sulfato (IS) e fosfato (Pi) e dos biomarcadores inflamatórios Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP 1), Interleukin 8 (IL-8), Intercellular Adhesion Molecule 1 solúvel (ICAM-1s) e Vascular Cell Adhesion Molecule 1 solúvel (VCAM-1s). Em outra coorte, foram avaliadas a expressão de Vascular Endothelial Cadherin (VE-caderina) e Zonula occludens-1 (ZO-1) em artérias ilíacas e renais de pacientes com DRC (receptores) e de doadores (controles), coletados durante transplante renal. In vitro, células endoteliais humanas foram tratadas com PCS, IS e Pi nas concentrações máximas urêmicas e com pool de soros dos pacientes, agrupados em diferentes estágios de uremia. A viabilidade, permeabilidade e morfologia celular foram avaliadas por MTT, transwell e microscopia eletrônica de varredura (MEV), respectivamente. As expressões gênicas de VE-caderina e ZO-1 foram avaliadas por RT-qPCR e as expressões proteicas por Western Blot, imunofluorescência e citometria de fluxo. In vivo, MCP-1, VCAM-1s, PCR-US e todas as toxinas testadas correlacionaram-se significativamente com a TFG (P<0,001; P<0,0001; P<0,01 e P<0,0001). Nas artérias de doadores observou-se um endotélio intacto formando uma monocamada contínua com forte expressão de VE-caderina e ZO-1, o que não foi observado nas artérias de receptores. In vitro, houve um aumento significativo na permeabilidade celular, especialmente em células tratadas com Pi e pools urêmicos (P<0,001). Através da MEV, observou-se que dentre as três toxinas testadas, Pi é a que induz maior perda de junção intercelular, semelhante ao efeito do soro urêmico em estágios mais severos de DRC. A expressão gênica e proteica de VE-caderina diminuíram significativamente (P<0,01), especialmente em células tratadas com Pi3 e todos os grupos urêmicos. Por outro lado, na análise de ZO-1, percebeu-se que embora a expressão gênica esteja significativamente aumentada (P<0,01), a expressão proteica está diminuída (P<0,05). Em resumo, demonstrou-se in vivo e in vitro que a uremia afeta as junções endoteliais, e quanto mais avançada a DRC, mais comprometimento endotelial. O impacto da uremia na expressão de VE-caderina e ZO-1 é mais significativo nos estágios moderado e severo da DRC e é distinto quando analisado separadamente cada toxina ou os soros urêmicos, o que sugere diferentes mecanismos fisiopatológicos. In vitro, demonstrou-se que a expressão gênica e proteica de VE-caderina estão diminuídos em estágios mais avançados de DRC. Entretanto, observou-se uma maior expressão gênica de ZO-1, porém uma menor expressão proteica, o que sugere uma possível regulação pós-transcricional e um papel regulador dessa proteína. Nosso estudo abre perspectivas para avaliar o envolvimento de inúmeras proteínas de junções intercelulares, a fim de elucidar a relação da uremia com a disfunção endotelial e permeabilidade vascular; Abstract: Endothelial dysfunction is common in patients with chronic kidney disease (CKD) and may result in the loss of intercellular junctions and thus contribute to the development of cardiovascular disease (CVD). The aim of the present study was to investigate in vivo and in vitro the impact of the uremic environment on vascular permeability. For this, sera from 80 patients were collected at different stages of CKD. Serum levels of uremic toxins p-cresyl sulfate (PCS), indoxyl sulfate (IS) and phosphate (Pi) and the inflammatory biomarkers Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1), Interleukin 8 (IL-8), Intercellular Adhesion Molecule 1 soluble (ICAM-1s) and Vascular Cell Adhesion Molecule 1 soluble (VCAM-1s) were measured. In another cohort, the expression of Vascular Endothelial Cadherin (VE-cadherin) and Zonula occludens-1 (ZO-1) in the renal and iliac arteries of patients with CKD (receptors) and donors (controls) collected during renal transplantation were analyzed. In vitro, human endothelial cells were treated with PCS, IS and Pi at the maximum uremic and serum pool concentrations of patients, grouped at different stages of uremia. The viability, permeability and cellular morphology were evaluated by MTT, transwell and scanning electron microscopy (SEM), respectively. The gene expression of VE-cadherin and ZO-1 were evaluated by RT-qPCR and the protein expression were evaluated by Western Blot, immunofluorescence and flow cytometry. In vivo, MCP-1, sVCAM-1, PCR-US and all toxins tested correlated significantly with GFR (P<0.001, P<0.0001, P<0.01 and P<0.0001). In the donor arteries an intact endothelium was observed forming a continuous monolayer with strong expression of VE-cadherin and ZO 1, which was not observed in the recipient arteries. In vitro, there was a significant increase in cell permeability, especially in cells treated with Pi and uremic pools (P<0.001). Through SEM, it was observed that among the three toxins tested, Pi is the one that induces greater loss of intercellular junction, similar to the effect of uremic serum in more severe stages of CKD. Genetic and protein expression of VE-cadherin decreased significantly (P<0.01), especially in cells treated with Pi3 and all uremic groups. On the other hand, in the analysis of ZO-1, it was observed that although the gene expression was significantly increased (P<0.01), the protein expression was decreased (P<0.05). In summary, uremia has been shown in vivo and in vitro to affect endothelial junctions, and the more advanced the CKD, the more endothelial involvement. The impact of uremia on the expression of VE-cadherin and ZO-1 is more significant in the moderate and severe stages of CKD and is distinct when analyzed separately for each toxin or uremic sera, suggesting different pathophysiological mechanisms. In vitro, it has been demonstrated that the gene and protein expression of VE-cadherin are decreased in more advanced stages of CKD. However, a greater gene expression of ZO-1 was observed, but a lower protein expression, which suggests a possible post-transcriptional regulation and a regulating role of this protein. Our study opens perspectives to evaluate the involvement of innumerable intercellular junction proteins in order to elucidate the relationship of uremia with endothelial dysfunction and vascular permeability Orientadora: Profa Dra Andréa Emilia Marques Stinghen; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 18/05/2018; Inclui referências

Desenvolvimento de um scFv adaptado para triagem/diagnóstico da doença renal crônica

2026-05-04T21:38:36Z

Desenvolvimento de um scFv adaptado para triagem/diagnóstico da doença renal crônica Resumo: O acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGEs) está associado a diversasdoenças, devido à má filtração renal, em especial com a progressão da Doença RenalCrônica (DRC). A dosagem desses analitos em soro de pacientes desperta grande interessepara fins diagnósticos e terapêuticos. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi a utilizaçãodo fragmento variável de cadeia única (scFv) de um anticorpo para a concepção de umbiossensor, que possa ser empregado em um teste de diagnóstico e favorecer a detecçãode AGEs em pacientes com DRC. Para tanto, soro albumina humana (HSA) foi modificadopara obtenção de carboximetillisina, a molécula CML, formando HSA-CML, que é um AGEamplamente estudado. O anticorpo monoclonal mAb2D6G2 serviu como protótipo naconstrução do scFv. O gene sintético codificante para o scFv foi clonado em vetor deexpressão para produção da molécula recombinante em sistema heterólogo. Acaracterização funcional do fragmento de anticorpo foi realizada por imunoensaios comoWestern Blotting e ELISA. A eficiência de glicação, de HSA-CML, foi demonstrada por meioda mobilidade eletroforética e confirmada por análise de espectrometria de massa. O scFvreagiu de maneira dose-dependente frente a HSA-CML evidenciado por ELISA, e manteveo mesmo perfil de reconhecimento à molécula-alvo quando comparado ao anticorpomonoclonal de origem. Nos experimentos de ELISA de competição o scFv foi eficiente emdetectar diferentes concentrações de HSA-CML presente nas amostras de soro humanocontaminado artificialmente. Um estudo mais detalhado desse scFv permitirá seu empregocomo biossensor para analisar soros de pacientes com DRC.; Abstract: The accumulation of advanced glycation end products (AGEs) is associated with variousdiseases due to impaired renal filtration, particularly with the progression of Chronic KidneyDisease (CKD). Measuring these analytes in patient serum has garnerated significantinterest for both diagnostic and therapeutic purposes. In this context, the objective of thisstudy was to utilize the single-chain variable fragment (scFv) of an antibody to develop abiosensor that could be employed in diagnostic tests, facilitating the detection of AGEs inCKD patients. To this end, human serum albumin (HSA) was modified to obtaincarboxymethyllysine (CML), forming HSA-CML, a well-studied AGE. The monoclonalantibody mAb2D6G2 was used as a prototype for devoloping the scFv. The synthetic genecoding for the scFv was cloned into an expression vector for the production of therecombinant molecule in a heterologous system. The functional characterization of theantibody fragment was performed using immunoassays including Western Blotting andELISA. The efficiency of HSA glycation to form HSA-CML was demonstrated throughelectrophoretic mobility and confirmed by mass spectrometry analysis. The scFv showeddose-dependent reactivity to HSA-CML, as evidenced by ELISA, and maintained the samerecognition profile for the target molecule when compared to the original monoclonalantibody. In competition ELISA experiments, the scFv successfully detected differentconcentrations of HSA-CML in artificially contaminated human serum samples. A moredetailed study of this scFv will allow its application as a biosensor to analyze serum samplesfrom CKD patients. Orientadora: Prof.ª(a). Dr(a). Larissa Magalhães Alvarenga; Coorientador: Profº. Dr. Wanderson Duarte da Rocha; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 28/10/2024; Inclui referências; Área de concentração: Microbiologia

Vigilância entomológica de triatomíneos : análise da distribuição espacial e identificação da infecção natural por Trypanosoma cruzi, no Estado do Paraná, Brasil

2026-04-10T17:14:13Z

Vigilância entomológica de triatomíneos : análise da distribuição espacial e identificação da infecção natural por Trypanosoma cruzi, no Estado do Paraná, Brasil Resumo: A distribuição dos vetores da doença de Chagas e suas potenciais associações com humanos e taxas de infectividade pelo Trypanosoma cruzi permitem identificar regiões de maior risco da doença, além de favorecer tomadas de decisões assertivas em saúde pública. O trabalho teve dois objetivos, um deles vinculado a estimar a infectividade de triatomíneos por meio da amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) e, em um segundo momento, avaliar a distribuição dos triatomíneos encontrados no estado do Paraná entre os anos de 2012 a 2021. Realizando a padronização da técnica de LAMP, com primers idealizados, alvos do gene da proteína ribossomal L3, foi possível amplificar amostras de fezes de triatomíneos sem processo de extração de DNA. Os primers foram específicos, não apresentaram reatividade cruzada com outros parasitos. Ainda, foi possível expressar e purificar uma Bst DNA polimerase funcional, demonstrando que os custos em relação a técnica por LAMP podem ser reduzidos. A seleção dos primers e a região alvo de amplificação são inéditas considerando estudos de amplificação por LAMP com o DNA de T. cruzi. Porém, apesar de promissora, as amplificações apresentaram limitações no processo de reprodução, precisando ser ajustado o processo de padronização, da técnica de LAMP, as dificuldades de amplificação podem estar relacionadas, por exemplo, com a qualidade das amostras ambientais encaminhadas. Já aplicando a modelagem de nicho ecológico com os vetores encontrados no Paraná, os mesmos, apresentaram uma alta adequabilidade climática e paisagística, principalmente na região norte. A espécie Panstrongylus megistus mostrou-se domiciliada no estado do Paraná. Ainda, as amostras apresentaram uma alta taxa de infectividade, em torno de 22,7%, valor este, que aumentou nos últimos anos. Esses achados permitiram avançar um pouco mais sobre o conhecimento dos elementos relevantes no contexto da doença de Chagas, como também, reforçou a necessidade de realização de mais estudos para a proposição efetiva de métodos mais sensíveis com baixo custo, que possam ser empregados rapidamente para confirmação da infectividade dos barbeiros encontrados nos ambientes peri e intradomiciliar; Abstract: The distribution of Chagas disease vectors and their potential associations with humans and infectivity rates by Trypanosoma cruzi allow the identification of regions at higher risk of the disease, in addition to favoring assertive decision-making in public health. The study had two objectives, one of which was linked to estimating the infectivity of triatomines through loop-mediated amplification (LAMP) and, secondly, to evaluate the distribution of triatomines found in the state of Paraná between 2012 and 2021. By standardizing the LAMP technique, with idealized primers targeting the ribosomal protein L3 gene, it was possible to amplify triatomine fecal samples without a DNA extraction process. The primers were specific and did not show cross-reactivity with other parasites. Furthermore, it was possible to express and purify a functional Bst DNA polymerase, demonstrating that costs in relation to the LAMP technique can be reduced. The selection of primers and the target region for amplification are unprecedented considering LAMP amplification studies with T. cruzi DNA. However, despite being promising, the amplifications presented limitations in the reproduction process, requiring adjustments to the standardization process of the LAMP technique. The amplification difficulties may be related, for example, to the quality of the environmental samples sent. Applying ecological niche modeling to the vectors found in Paraná, they showed high climatic and landscape suitability, especially in the northern region. The species Panstrongylus megistus was shown to be domiciled in the state of Paraná. Furthermore, the samples presented a high infectivity rate, around 22.7%, a value that has increased in recent years. These findings allowed us to advance a little further in our knowledge of the relevant elements in the context of Chagas disease, as well as reinforcing the need to carry out further studies to effectively propose more sensitive, low-cost methods that can be quickly used to confirm the infectivity of barber bugs found in peri- and intra-household environments Orientador: Profa. Dra. Larissa Magalhães Alvarenga; Coorientador: Prof. Dr. Andrey José de Andrade e Prof. Dr. Wanderson D. da Rocha; Banca: Larissa Magalhães Alvarenga (Presidente da Banca), Magda Clara Vieira da Costa Ribeiro, Mateus Nobrega Aoki e Débora do Rocio Klisiowicz; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 06/05/2025; Inclui referências

Epidemiologia ambiental de parasitos em matrizes aquáticas e arenosas destinadas à prática de desportos profissionais e amadores no Paraná e Santa Catarina

2026-04-06T19:13:49Z

Epidemiologia ambiental de parasitos em matrizes aquáticas e arenosas destinadas à prática de desportos profissionais e amadores no Paraná e Santa Catarina Resumo: A prática de desportos é um fator essencial para a manutenção da saúde. Contudo, modalidades esportivas praticadas em ambiente aberto, onde o contato é frequente com a água e areia, eventualmente contaminadas, pode representar um risco para os esportistas, especialmente por parasitos que apresentam ampla resistência ambiental como cistos de Giardia spp., oocistos de Cryptosporidium spp., e Toxoplasma gondii e, ovos de helmintos. O presente estudo traz um panorama da qualidade desses ambientes, especialmente durante a prática de competições esportivas realizada em dois estados do sul do Brasil. Ao redor do mundo, as legislações que regem a balneabilidade de ambientes utilizados para recreação em águas brutas e águas tratadas como as piscinas, não contemplam a pesquisa de parasitos. Do mesmo modo, esse aspecto não é contemplado no Brasil. Ressalta-se que a avaliação da qualidade parasitológica e microbiológica de ambientes aquáticos e arenosos realizada durante a execução de competições esportivas oficiais, nunca foi realizada. O principal objetivo desse estudo foi avaliar a qualidade sanitária de ambientes aquáticos e arenosos utilizados para a prática de diferentes modalidades esportivas por atletas profissionais, ou amadores no Estado do Paraná e Santa Catarina. Foram estabelecidas 16 áreas de práticas de esportes aquáticos e arenosos, como surf, Triathlon, travessias aquáticas, vôlei de piscina, tênis e futebol de areia, entre outros, de ambos os estados. No período de novembro de 2023 a dezembro de 2024, 50 amostras de diferentes matrizes hídricas (água do mar, água superficial e água de retrolavagem de piscinas) foram coletadas para pesquisa de protozoários patogênicos e bactérias indicadoras de contaminação fecal (BICF), e 95 amostras de areia para pesquisa de helmintos. As amostras hídricas foram analisadas pela técnica de filtração em membranas, seguida da purificação por separação imunomagnética e reação de imunofluorescência direta para a pesquisa de Cryptosporidium e Giardia. Todas as amostras foram submetidas à extração de DNA para realização de PCR e qPCR para detecção de ambos os protozoários intestinais e de T. gondii. A pesquisa de bactérias indicadoras de contaminação fecal (BICF) foi realizada por filtração em membranas, semeadura em meio cromogênico e contagem de colônias, seguido de identificação por MALDI-TOF. A detecção de helmintos em areia foi feita mediante homogeneização das amostras com Glicina 1M pH 5,5 ou Triton™ X - 100 (0,1%) de acordo com a composição granulométrica da areia, seguida de centrifugação ou centrífugo-flutuação, e posterior flutuação em sacarose d=1,24. A presença de ao menos um dos protozoários pesquisados foi detectada em 6 das 7 áreas aquáticas contempladas e analisadas no presente estudo, onde cistos de Giardia spp., foram detectados com maior frequência em águas salinas e doces, seguido da contaminação por T. gondii, detectado pela primeira vez em água do mar no Brasil, e em menor frequência, por Cryptosporidium spp. O monitoramento conjunto de duas BICF mostrou-se relevante para atestar a qualidade de ambientes aquáticos, especialmente para Enterococcus sp., onde as principais espécies isoladas foram E. faecalis/E. faecium e em menor frequência, E. gallinarum e E. hirae. Quanto a contaminação de areias, 14,7% das amostras (n=14/95) apresentaram contaminação por ovos de helmintos ou larvas de nematódeos. Em conclusão, o presente estudo demonstra importante contaminação dos ambientes aquáticos e arenosos utilizados para recreação e prática de desportos em dois estados do sul do Brasil. A avaliação da qualidade das águas e dos ambientes arenosos é relevante para a garantia da segurança e saúde de atletas profissionais ou amadores. Através do controle da qualidade desses ambientes, é possível identificar a presença e origem de contaminantes nocivos à saúde, podendo atuar como estratégia de prevenção de aquisição de doenças parasitárias; Abstract: Sports practice is an essential factor for maintaining health. However, sports practiced in outdoor environments, where there is frequent contact with water and sand, which may be contaminated, can pose a risk to athletes, especially due to parasites that have broad environmental resistance, such as Giardia spp., cysts, Cryptosporidium spp., oocysts, and Toxoplasma gondii and helminth eggs. The present study provides an overview of the quality of these environments, especially during sports competitions held in two southern states of Brazil. Around the world, legislation governing the bathing suitability of environments used for recreation in raw water and treated water, such as swimming pools, does not include parasite testing. Likewise, this aspect is not covered in Brazil. It is noteworthy that the evaluation of the parasitological and microbiological quality of aquatic and sandy environments carried out during official sports competitions has never been performed. The main objective of this study was to evaluate the sanitary quality of aquatic and sandy environments used for the practice of different sports modalities by professional or amateur athletes in the states of Paraná and Santa Catarina. Sixteen areas destined for the practice of aquatic and sandy sports, such as surfing, triathlon, water crossings, pool volleyball, tennis and beach soccer, among others, were established at both states. From November 2023 to December 2024, 50 samples of different water matrices (seawater, surface water and backwash pool water) were collected to search for pathogenic protozoa and fecal indicator bacteria (FIB), and 95 sand samples were collected to search for helminths. Water samples were analyzed by the membrane filtration technique, followed by purification by immunomagnetic separation and direct immunofluorescence reaction for the detection of Cryptosporidium and Giardia. All samples were subjected to DNA extraction followed by PCR and qPCR to detect both intestinal protozoa and T. gondii. FIB were screened by membrane filtration, chromogenic seeding and colony counting, followed by identification by MALDI-TOF. Helminths were detected in sand by homogenizing the samples with 1M Glycine pH 5.5 or Triton™ X - 100 (0.1%) according to the sand particle size composition, followed by centrifugation or centrifugal flotation, and subsequent flotation in sucrose d=1.24. The presence of at least one of the protozoa studied was detected in 6 of the 7 aquatic areas covered and analyzed in this study, where cysts of Giardia spp. were detected more frequently in saline and fresh waters, followed by contamination by T. gondii, detected for the first time in seawater in Brazil, and less frequently, by Cryptosporidium spp. The concomitant monitoring of two FIB proved to be relevant to attest the quality of aquatic environments, especially for Enterococcus sp., where the main isolated species were E. faecalis/E. faecium and to a less frequently, E. gallinarum and E. hirae. Regarding sand contamination, 14.7% of the samples (n=14/95) showed contamination by helminth eggs or nematode larvae. In conclusion, this study demonstrates significant contamination of aquatic and sandy environments used for recreation and sports in two southern states of Brazil. Assessing the quality of water and sandy environments is important to ensure the safety and health of professional and amateur athletes. By controlling the quality of these environments, it is possible to identify the presence and origin of contaminants that are harmful to health and can act as a strategy to prevent the acquisition of parasitic diseases Orientador: Prof. Dr. Diego Averaldo Guiguet Leal; Coorientadores: Drª Maria Aparecida Moraes Marciano e Prof.ª. Drª. Keite da Silva Nogueira; Banca: Diego Averaldo Guiguet Leal (Presidente da Banca), Ricardo Toshio Fujiwara e Ida Chapal Pimentel; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de CIências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 30/05/2025; Inclui referências; Área de concentração: Microbiologia