40001016044P0 Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia

Caracterização celular e molecular de clones de Giardia intestinalis

2026-06-25T15:01:51Z

Caracterização celular e molecular de clones de Giardia intestinalis Resumo: Giardia intestinalis é um protozoário responsável pela giardíase, uma doença negligenciada que afeta milhões de pessoas anualmente. Este estudo caracterizou clones de G. intestinalis derivados de um isolado clínico de um paciente crônico, com ênfase na produção de vesículas extracelulares (VEs) e sua relação com a patogênese. Foram identificados e analisados os clones LWB1, LR051, LR231 e LR441, que apresentaram diferenças significativas em seus perfis de crescimento, adesão às células intestinais e produção de VEs sob diferentes estímulos, incluindo cálcio e fármacos antiparasitários (Albendazol e Nitazoxanida). O clone LR051 destacou-se como o maior produtor de VEs, especialmente vesículas extracelulares grandes (LEVs), com uma produção superior à dos demais clones e à cepa de referência WB. As VEs deste clone demonstraram papel fundamental na adesão às células epiteliais e na modulação imunológica, além de apresentarem produção dose-dependente frente à exposição ao Albendazol, sugerindo um mecanismo de defesa frente ao estresse. O clone LR231, por sua vez, mostrou maior resistência ao Albendazol, enquanto os clones LWB1 e LR441 apresentaram menores taxas de adesão e produção de VEs em comparação ao LR051. Os resultados ressaltam a diversidade clonal de G. intestinalis e seu impacto na patogênese, destacando como diferentes clones utilizam estratégias únicas para sobreviver e interagir com o hospedeiro. Este estudo fornece novas percepções sobre o papel das VEs e sua relação com a diversidade clonal, abrindo caminhos para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas contra infecções por G. intestinalis; Abstract: Giardia intestinalis is a protozoan responsible for giardiasis, a neglected disease that affects millions of people annually. This study characterized G. intestinalis clones derived from a clinical isolate from a chronic patient, with emphasis on the production of extracellular vesicles (EVs) and their relationship with pathogenesis. Clones LWB1, LR051, LR231 and LR441 were identified and analyzed, which showed significant differences in their growth profiles, adhesion to intestinal cells and production of EVs under different stimuli, including calcium and antiparasitic drugs. The LR051 clone stood out as the largest producer of EVs, especially large extracellular vesicles (LEVs), with higher production than the other clones and the WB reference strain. The EVs of this clone showed a fundamental role in adhesion to epithelial cells and immune modulation, in addition to presenting dose-dependent production in the face of exposure to Albendazole, suggesting a defense mechanism against stress. The LR231 clone, in turn, showed higher resistance to Albendazole, while the LWB1 and LR441 clones showed lower rates of adhesion and EV production compared to LR051. The results underscore the clonal diversity of G. intestinalis and its impact on pathogenesis, highlighting how different clones utilize unique strategies to survive and interact with the host. This study provides new insights into the role of EVs and their relationship with clonal diversity, paving the way for the development of targeted therapeutic strategies against G. intestinalis infections Orientador: Prof.ª Dr. Marcel Ivan Ramirez Araya; Banca: Marcel Ivan Ramirez Araya (Presidente da Banca), Álvaro Luiz Bertho dos Santos, Maria Cristina Leme Godoy dos Santos; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 12/02/2025; Inclui referências

Atividade antitumoral do complexo binuclear de oxidovanádio (IV) e oxalato em linhagens de câncer de mama

2026-06-24T11:47:08Z

Atividade antitumoral do complexo binuclear de oxidovanádio (IV) e oxalato em linhagens de câncer de mama Resumo: Até 2045, estima-se que ocorram 6 milhões de novos casos de câncer no mundo, dos quais 1 milhão serão de câncer de mama (CM). No brasil, dos 184 mil novos diagnósticos de câncer, quase 50 mil estarão relacionados ao câncer de mama. O subtipo de CM mais agressivo é o triplo negativo (TN) que apesar de representar em torno de 15% dos casos, não tem terapia específica e apresenta baixa taxa de sobrevivência, necessitando, portanto, de novos tipos de tratamento. Os compostos de oxidovanádio podem ter diversas formulações e muitos possuem potencial anticâncer ao ativar fatores de transcrição e vias de sinalização celular, resultando em supressão do crescimento tumoral e morte celular. Este trabalho teve por objetivo avaliar o complexo binuclear de oxidovanádio(IV) de fórmula (ET3NH)2 [{VO(OH}2 )(OX)2 (µ–OX)] OR VOX2), onde ox = oxalato (V2). Sendo assim, foi avaliada a citotoxicidade desse composto em células de câncer de mama humano MDA-MB-231, murino 4T1, luminal MCF7 e HB4a por MTT e o V2 mostrou efeito citotóxico tanto para a linhagem controle (HB4a) quanto para as linhagens de câncer. Para a linhagem MDA-MB-231 foi realizado o protocolo do ensaio de wound healing e verificou-se que o composto diminui a migração celular. Porém não houve aumento da expressão de CDH1 (gene da E-caderina) pelo ensaio de qPCR, o que significa provável ausência de efeito anti-metastático. O breve estudo de expressão gênica na linhagem TN humana identificou o aumento da expressão dos genes BAX e CASP8 que significam que ocorreu apoptose e RIPK3, RIPK1 e MLKL, sendo então sugestivo da morte celular do tipo necroptose. Foi também avaliado o estresse oxidativo nas linhagens, possuindo uma relação inversamente proporcional à toxicidade observada. Por fim, foi avaliada a combinação entre o composto e os quimioterápicos paclitaxel e doxorrubicina, mostrando um sinergismo com o V2 para ambos na indução da morte celular; Abstract: By 2045, 6 million new cancer cases are expected worldwide, of which 1 million will be breast cancer (BC). In Brazil, out of 184,000 new cancer diagnoses, nearly 50,000 will be related to breast cancer. The most aggressive BC subtype is triple-negative (TN), which, despite accounting for approximately 15% of cases, lacks specific therapy and has a low survival rate, thus requiring new treatment options. Oxidovanadium compounds can have various formulations, and many exhibit anticancer potential by activating transcription factors and cellular signaling pathways, leading to tumor growth suppression and cell death. This study aims to evaluate the binuclear oxidovanadium(IV) complex with the formula (ET3NH)2 [{VO(OH}2 )(OX)2 (µ–OX)] OR VOX2), where ox = oxalate (V2).Cytotoxicity in human breast cancer cell lines MDA-MB-231, murine 4T1, luminal MCF7, and HB4a was assessed using the MTT assay, and V2 demonstrated cytotoxic effects on both normal and cancer cell lines. The wound healing assay was performed for the MDA-MB-231 cell line, revealing that the compound reduces cell migration. But no CDH1 gene of e-cadherin was observed, then no ani-metastatic effect could be involved. Additionally the brief gene expression study identified increased expression of BAX and CASP8 indicated apoptosis and RIPK3, RIPK1, and MLKL genes in the TN human cell line, suggesting necroptosis. Oxidative stress was also evaluated in the cell lines, showing an inverse relationship with the observed toxicity. Finally, the combination of the compound with the chemotherapeutic agents paclitaxel and doxorubicin was assessed, revealing a synergistic effect with V2 for both drugs Orientadora: Prof(a). Dr(a). Giseli Klassen; Coorientadora: Prof(a). Dr(a). Giovana Gioppo Nunes; Banca: Giseli Klassen (Presidente da Banca), Juliana Ferreira de Moura, Adriana Frohlich Mercadante; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 27/02/2025; Inclui referências

Estudo dos mecanismos envolvidos na permeabilidade vascular relacionada à toxicidade urêmica

2026-05-05T13:35:19Z

Estudo dos mecanismos envolvidos na permeabilidade vascular relacionada à toxicidade urêmica Resumo: A disfunção endotelial é frequente em pacientes com doença renal crônica (DRC) e pode resultar na perda de junções intercelulares e assim contribuir para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCV). O objetivo do presente estudo foi investigar in vivo e in vitro o impacto do ambiente urêmico na permeabilidade vascular. Para tanto, foram coletados soros de 80 pacientes em diferentes estágios de DRC. Foram dosados os níveis séricos das toxinas urêmicas p-cresil sulfato (PCS), indoxil sulfato (IS) e fosfato (Pi) e dos biomarcadores inflamatórios Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP 1), Interleukin 8 (IL-8), Intercellular Adhesion Molecule 1 solúvel (ICAM-1s) e Vascular Cell Adhesion Molecule 1 solúvel (VCAM-1s). Em outra coorte, foram avaliadas a expressão de Vascular Endothelial Cadherin (VE-caderina) e Zonula occludens-1 (ZO-1) em artérias ilíacas e renais de pacientes com DRC (receptores) e de doadores (controles), coletados durante transplante renal. In vitro, células endoteliais humanas foram tratadas com PCS, IS e Pi nas concentrações máximas urêmicas e com pool de soros dos pacientes, agrupados em diferentes estágios de uremia. A viabilidade, permeabilidade e morfologia celular foram avaliadas por MTT, transwell e microscopia eletrônica de varredura (MEV), respectivamente. As expressões gênicas de VE-caderina e ZO-1 foram avaliadas por RT-qPCR e as expressões proteicas por Western Blot, imunofluorescência e citometria de fluxo. In vivo, MCP-1, VCAM-1s, PCR-US e todas as toxinas testadas correlacionaram-se significativamente com a TFG (P<0,001; P<0,0001; P<0,01 e P<0,0001). Nas artérias de doadores observou-se um endotélio intacto formando uma monocamada contínua com forte expressão de VE-caderina e ZO-1, o que não foi observado nas artérias de receptores. In vitro, houve um aumento significativo na permeabilidade celular, especialmente em células tratadas com Pi e pools urêmicos (P<0,001). Através da MEV, observou-se que dentre as três toxinas testadas, Pi é a que induz maior perda de junção intercelular, semelhante ao efeito do soro urêmico em estágios mais severos de DRC. A expressão gênica e proteica de VE-caderina diminuíram significativamente (P<0,01), especialmente em células tratadas com Pi3 e todos os grupos urêmicos. Por outro lado, na análise de ZO-1, percebeu-se que embora a expressão gênica esteja significativamente aumentada (P<0,01), a expressão proteica está diminuída (P<0,05). Em resumo, demonstrou-se in vivo e in vitro que a uremia afeta as junções endoteliais, e quanto mais avançada a DRC, mais comprometimento endotelial. O impacto da uremia na expressão de VE-caderina e ZO-1 é mais significativo nos estágios moderado e severo da DRC e é distinto quando analisado separadamente cada toxina ou os soros urêmicos, o que sugere diferentes mecanismos fisiopatológicos. In vitro, demonstrou-se que a expressão gênica e proteica de VE-caderina estão diminuídos em estágios mais avançados de DRC. Entretanto, observou-se uma maior expressão gênica de ZO-1, porém uma menor expressão proteica, o que sugere uma possível regulação pós-transcricional e um papel regulador dessa proteína. Nosso estudo abre perspectivas para avaliar o envolvimento de inúmeras proteínas de junções intercelulares, a fim de elucidar a relação da uremia com a disfunção endotelial e permeabilidade vascular; Abstract: Endothelial dysfunction is common in patients with chronic kidney disease (CKD) and may result in the loss of intercellular junctions and thus contribute to the development of cardiovascular disease (CVD). The aim of the present study was to investigate in vivo and in vitro the impact of the uremic environment on vascular permeability. For this, sera from 80 patients were collected at different stages of CKD. Serum levels of uremic toxins p-cresyl sulfate (PCS), indoxyl sulfate (IS) and phosphate (Pi) and the inflammatory biomarkers Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1), Interleukin 8 (IL-8), Intercellular Adhesion Molecule 1 soluble (ICAM-1s) and Vascular Cell Adhesion Molecule 1 soluble (VCAM-1s) were measured. In another cohort, the expression of Vascular Endothelial Cadherin (VE-cadherin) and Zonula occludens-1 (ZO-1) in the renal and iliac arteries of patients with CKD (receptors) and donors (controls) collected during renal transplantation were analyzed. In vitro, human endothelial cells were treated with PCS, IS and Pi at the maximum uremic and serum pool concentrations of patients, grouped at different stages of uremia. The viability, permeability and cellular morphology were evaluated by MTT, transwell and scanning electron microscopy (SEM), respectively. The gene expression of VE-cadherin and ZO-1 were evaluated by RT-qPCR and the protein expression were evaluated by Western Blot, immunofluorescence and flow cytometry. In vivo, MCP-1, sVCAM-1, PCR-US and all toxins tested correlated significantly with GFR (P<0.001, P<0.0001, P<0.01 and P<0.0001). In the donor arteries an intact endothelium was observed forming a continuous monolayer with strong expression of VE-cadherin and ZO 1, which was not observed in the recipient arteries. In vitro, there was a significant increase in cell permeability, especially in cells treated with Pi and uremic pools (P<0.001). Through SEM, it was observed that among the three toxins tested, Pi is the one that induces greater loss of intercellular junction, similar to the effect of uremic serum in more severe stages of CKD. Genetic and protein expression of VE-cadherin decreased significantly (P<0.01), especially in cells treated with Pi3 and all uremic groups. On the other hand, in the analysis of ZO-1, it was observed that although the gene expression was significantly increased (P<0.01), the protein expression was decreased (P<0.05). In summary, uremia has been shown in vivo and in vitro to affect endothelial junctions, and the more advanced the CKD, the more endothelial involvement. The impact of uremia on the expression of VE-cadherin and ZO-1 is more significant in the moderate and severe stages of CKD and is distinct when analyzed separately for each toxin or uremic sera, suggesting different pathophysiological mechanisms. In vitro, it has been demonstrated that the gene and protein expression of VE-cadherin are decreased in more advanced stages of CKD. However, a greater gene expression of ZO-1 was observed, but a lower protein expression, which suggests a possible post-transcriptional regulation and a regulating role of this protein. Our study opens perspectives to evaluate the involvement of innumerable intercellular junction proteins in order to elucidate the relationship of uremia with endothelial dysfunction and vascular permeability Orientadora: Profa Dra Andréa Emilia Marques Stinghen; Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 18/05/2018; Inclui referências

Desenvolvimento de um scFv adaptado para triagem/diagnóstico da doença renal crônica

2026-05-04T21:38:36Z

Desenvolvimento de um scFv adaptado para triagem/diagnóstico da doença renal crônica Resumo: O acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGEs) está associado a diversasdoenças, devido à má filtração renal, em especial com a progressão da Doença RenalCrônica (DRC). A dosagem desses analitos em soro de pacientes desperta grande interessepara fins diagnósticos e terapêuticos. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi a utilizaçãodo fragmento variável de cadeia única (scFv) de um anticorpo para a concepção de umbiossensor, que possa ser empregado em um teste de diagnóstico e favorecer a detecçãode AGEs em pacientes com DRC. Para tanto, soro albumina humana (HSA) foi modificadopara obtenção de carboximetillisina, a molécula CML, formando HSA-CML, que é um AGEamplamente estudado. O anticorpo monoclonal mAb2D6G2 serviu como protótipo naconstrução do scFv. O gene sintético codificante para o scFv foi clonado em vetor deexpressão para produção da molécula recombinante em sistema heterólogo. Acaracterização funcional do fragmento de anticorpo foi realizada por imunoensaios comoWestern Blotting e ELISA. A eficiência de glicação, de HSA-CML, foi demonstrada por meioda mobilidade eletroforética e confirmada por análise de espectrometria de massa. O scFvreagiu de maneira dose-dependente frente a HSA-CML evidenciado por ELISA, e manteveo mesmo perfil de reconhecimento à molécula-alvo quando comparado ao anticorpomonoclonal de origem. Nos experimentos de ELISA de competição o scFv foi eficiente emdetectar diferentes concentrações de HSA-CML presente nas amostras de soro humanocontaminado artificialmente. Um estudo mais detalhado desse scFv permitirá seu empregocomo biossensor para analisar soros de pacientes com DRC.; Abstract: The accumulation of advanced glycation end products (AGEs) is associated with variousdiseases due to impaired renal filtration, particularly with the progression of Chronic KidneyDisease (CKD). Measuring these analytes in patient serum has garnerated significantinterest for both diagnostic and therapeutic purposes. In this context, the objective of thisstudy was to utilize the single-chain variable fragment (scFv) of an antibody to develop abiosensor that could be employed in diagnostic tests, facilitating the detection of AGEs inCKD patients. To this end, human serum albumin (HSA) was modified to obtaincarboxymethyllysine (CML), forming HSA-CML, a well-studied AGE. The monoclonalantibody mAb2D6G2 was used as a prototype for devoloping the scFv. The synthetic genecoding for the scFv was cloned into an expression vector for the production of therecombinant molecule in a heterologous system. The functional characterization of theantibody fragment was performed using immunoassays including Western Blotting andELISA. The efficiency of HSA glycation to form HSA-CML was demonstrated throughelectrophoretic mobility and confirmed by mass spectrometry analysis. The scFv showeddose-dependent reactivity to HSA-CML, as evidenced by ELISA, and maintained the samerecognition profile for the target molecule when compared to the original monoclonalantibody. In competition ELISA experiments, the scFv successfully detected differentconcentrations of HSA-CML in artificially contaminated human serum samples. A moredetailed study of this scFv will allow its application as a biosensor to analyze serum samplesfrom CKD patients. Orientadora: Prof.ª(a). Dr(a). Larissa Magalhães Alvarenga; Coorientador: Profº. Dr. Wanderson Duarte da Rocha; Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 28/10/2024; Inclui referências; Área de concentração: Microbiologia