Xiloglucana Fucosilada de folhas de Hymenaea courbaril (Jatobá)

Abstract

Resumo: A xiloglucana fucosilada de Hymenaea courbaril, foi obtida por extração alcalina das folhas deslipidificadas, deslignificadas e despectinizadas. O polissacarídeo, purificado por cromatografia de troca-iônica, apresentou-se homogêneo por análise de HPSEC-MALLS. O índice de polidispersão e a conformação das xiloglucanas das folhas, bem como daquela obtida das sementes de H. courbaril, foram determinados, sendo que os valores de Rg x Mw obtidos indicam que o polissacarídeo estrutural apresenta forma em bastão e é mais polidisperso do que o de reserva, que apresenta conformação emaranhado ao acaso. A estrutura fina da xiloglucana fucosilada foi determinada. A análise de GC-MS dos acetatos de alditóis parcialmente metilados, utilizando-se NaBD4 na etapa de redução, demonstrou a presença do derivado 2,3-Me2-xilose, além do 3,4-Me2-xilose normalmente encontrado. Este resultado foi confirmado através da obtenção de aldonitrilos acetilados parcialmente metilados. RMN bidimensional indicou que as unidades de xilose substituídas somente por galactose apresentam ligação em 0-2, enquanto que as unidades substituídas pelo dissacarídeo fucosil-galactose provavelmente apresentam a substituição em 0-4. A presença destas unidades de xilose substituídas em 0-4 é inédita em xiloglucanas, e indica uma nova galactosil transferase participando da biossíntese destas moléculas. Oligossacarídeos foram obtidos por hidrólise enzimática da xiloglucana estrutural, com endo-B( 1 ->4)glucanase de Trichoderma viride e endoxiloglucanase de A. aculeata. O material hidrolisado foi submetido a cromatografia analítica e analisado por HPAEC-PAD e ESI-MS, sendo que os oligossacarídeos XXXG, XLFG e XXFG correspondem a 90% do hidrolisado, em proporção de 1,3: 1,3: 1,0. A alta proporção do oligossacarídeo XLFG difere do esperado para xiloglucanas de parede celular primária do tipo I. O material hidrolisado foi fracionado por cromatografia de gel-permeação semi-preparativa BioGel P-2, sendo obtidas quatro frações: Hxg-1, Hxg-2, Hxg-3, Hxg-4 - A fração Hxg -1 (1,5%) , eluída no volume morto da coluna, é constituída por fragmentos de xiloglucana. Estes foram separados em BioGel P-60, e apresentaram maiores proporções relativas de galactose e fucose em comparação com o polissacarídeo, indicando que em Hxg-1 predominam cadeias laterais galactosiladas e fucosiladas. As frações Hxg-2, Hxg- foram submetidas à cromatografia preparativa por HPLC em coluna C-18. A partir da fração Hxg-3 foi obtido o oligossacarídeo purificado XXXG, analisado por RMN bidimensional. A cromatografia da fração Hxg-2 forneceu dois picos, sendo um deles correpondente ao XLFG purificado. A análise de RMN bidimensional deste oligossacarídeo comprova o mesmo padrão de substituição para as unidades de xilose encontrado no polissacarídeo. As xiloglucanas das folhas e das sementes, bem como seus respectivos oligossacarídeos, não apresentaram citotoxicidade sobre as células tumorais humanas (melanoma), nem induziram a proliferação dos linfócitos T. O oligossacarídeo XLFG apresentou interação com proteínas isoladas da membrana plasmática de protoplastos de Rubus fruticosus, indicando a presença de receptores para o decassacarídeo na membrana. Além disso, aumentou a atividade a-D-xilosidase e a-L-fucosidase nestes protoplastos.

Abstract: The fiicosylated xyloglucan from Hymenaea courbaril, was obtained by alkaline extration of defatted, delignified and pectin-free leaves. The polysaccharide, purified by ion-exchange chromatography, was homogeneous according to HPSEC-MALLS analysis. The polydispersity and the conformation of xyloglucan from the leaves, as well as that obtained from the seeds of H. courbaril, were determined. Its Rg x Mw indicated that the structural polysaccharide has a rod-like form and is more polydisperse than that of the reserve, with a random coil conformation. The fine structure of the fucosylated xyloglucan was determined. GC-MS analysis of partially (3-methylated alditol acetates, using NaBD4 in the reduction step, demonstrated the presence of a 2,3-Me2-xilose derivative. This result was confirmed by analysis of partially (9-methylated acetylated aldonitriles. Bidimensional RMN indicated that the units of xylose only substituted by galactose were 0-2 substituted, while those units substituted by the disaccharide group fucosyl-galactose are probably 0-4 substituted. The presence of the latter substitution is unique in xyloglucans, and indicates a new galactosyl transferase participating in the biosynthesis of these molecules. Oligosaccharides were produced by enzymatic hydrolysis of the structural xyloglucan with the endo- 1,4-P-Dglucanase from Trichoderma viride and endoxyloglucanase from A. aculeata.. The hidrolyzed material was analyzed by HPAEC-PAD and ESI-MS, where XXXG, XLFG and XXFG oligosaccharides corresponded to 90% of the total polysaccharide, in a ratio of 1,3: 1,3: 1,0. The high ratio of XLFG differs from that expected for type I primary cell wall xyloglucans. The hydrolyzed material was fractionated by semi-preparative gel-permeation chromatography on Biogel P-2, yielding four fractions: Hxg-1, Hxg-2, Hxg-3, Hxg-4 Fraction Hxg-1 (1,5 %), eluted in the void volume of the column, was composed of fragments of xyloglucan. These were separated on Biogel P-60, and showed higher relative ratios of galactose and fucose compared to that of the polysaccharide, indicating that in Hxg-1 galactosylated and fucosylated side chains predominate. Fractions Hxg-2 and Hxg-3 had been submitted to the HPLC preparative chromatography on a C-18 column. From fraction Hxg-3, purified oligosaccharide XXXG was obtained and analyzed by bidimensional NMR spectroscopy. Chromatography of fraction Hxg- gave rise two peaks, one of them corresponding to the purified XLFG. NMR bidimensional analysis of this oligosaccharide, indicated the same xylosyl substitution pattern as found in the polysaccharide. The seed and leaf xyloglucans, as well as their respective oligosaccharides, were not cytotoxic for the tumor cells, nor induced proliferation of T lynphocytes. XLFG interacted with isolated plasma membrane proteins of Rubus fruticosus protoplasts, indicating the presence of receptors for the decasaccharide on the membrane. Moreover, it induced the activities a-D-xylosidase and a-L-fucosidase in these protoplasts.