Isolamento de domínio variável de anticorpo de cadeia pesada e análise de interação com o domínio de ligação ao receptor da proteína S do vírus SARS-CoV-2

Abstract

Resumo: A pandemia de COVID-19 criou uma situação dramática a nível mundial. O número de mortes era superior a 6 milhões em 220 países até maio de 2022, segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS). De acordo com o Ministério da Saúde, em maio do mesmo ano o Brasil era o segundo país em número total de mortes. Apesar da redução de óbitos e casos graves graças à aplicação em massa das vacinas, estas não protegem 100% contra a infecção com o agravante de que algumas variantes são capazes de escapar à imunidade gerada pela vacina. As medidas farmacológicas que no início da pandemia estavam restritas à amenização dos sintomas passaram a dispor de alguns medicamentos e anticorpos, os quais, no Brasil, são recomendados apenas para os casos graves. Ademais, a circulação de variantes do vírus SARSCoV- 2 tende a perdurar, impondo a necessidade continuada da detecção das infecções ativas por testes rápidos como os de captura de antígenos virais. Neste projeto, avaliamos domínios variáveis de anticorpos de cadeia pesada (denominados VHH) descritos na literatura, isolados contra o domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína S de SARS-CoV-2. VHHs possuem características de estabilidade e baixa complexidade estrutural que tornam o seu uso contra alvos virais vantajoso. Através da análise das estruturas tridimensionais disponíveis dos complexos RBD-VHH, assim como de dados da interação RBD-VHHs disponíveis na literatura, um candidato, o VHH Sb#68, foi selecionado para prosseguimento dos trabalhos. A sequência deste VHH serviu de arcabouço em uma estratégia para a geração de variantes com maior afinidade para o RBD da proteína S de SARS-CoV-2. A geração de variantes foi realizada por evolução dirigida, onde oligonucleotídeos contendo mutações específicas promoveram substituições na sequência original através de reações de PCR. Após a indução da expressão das variantes, sua ligação ao RBD foi testada pela técnica de ELISA e 59 clones foram selecionados para sequenciamento do DNA. Diversas variantes mostraram resultados positivos de interação, uma delas com sinal superior ao obtido com o Sb#68 original, em nossas condições de ensaio. A análise da substituição de aminoácidos combinada com uma análise estrutural permitiu sugerir o efeito de algumas mutações na diminuição ou aumento de afinidade de variantes geradas para o VHH Sb68 ao domínio RBD da proteína S de SARS-CoV-2.

Abstract: The COVID-19 pandemic has created a dramatic situation worldwide. The number of deaths exceeded 6 million in 220 countries by April 2022, according to the World Health Organization (WHO). According to the Ministry of Health, in April of the same year Brazil was the second country in terms of total number of deaths. Despite the reduction in deaths and severe cases due to the mass application of vaccines, they do not protect 100% against infection and some variants are capable of escaping the immunity generated by the vaccines. At the beginning of the pandemics, the pharmacological measures were restricted to alleviation of symptoms. With time, some antiviral drugs and therapeutic antibodies were made available, although in the Brazilian medical system they are recommended for severe cases only. Furthermore, circulation of SARS-CoV-2 virus variants tends to persist, imposing the continued need for the detection of active infections by rapid tests such as those for capturing viral antigens. In this project we evaluated variable domains of heavy chain antibodies (called VHH) described in the literature, isolated against the receptor binding domain (RBD) of the S protein of SARS-CoV-2. VHHs have characteristics of stability and low structural complexity that make their use against viral targets advantageous. Through the analysis of the available three-dimensional structures of RBD-VHH complexes, as well as data on the RBD-VHHs interaction available in the literature, a candidate, the VHH Sb#68, was selected for further work. The sequence of this VHH served as a framework in a strategy for the generation of variants with higher affinity for the RBD of the S protein of SARS-CoV-2. The generation of variants was performed by directed evolution, where oligonucleotides containing specific mutations promoted substitutions in the original sequence through PCR reactions. After inducing the expression of the variants, their binding to RBD was tested by the ELISA technique and 59 clones were selected for DNA sequencing. Several variants showed positive interaction results, one of them with a signal superior to that obtained with the original Sb#68, under our test conditions. The analysis of amino acid substitution combined with a structural analysis allowed us to suggest the effect of some mutations in decreasing or increasing the affinity of variants generated for the VHH Sb68 to the RBD domain of the S protein of SARS-CoV-2.