Produção de xilanase em resíduos agroindustriais pos Streptomyces viridosporus T7A e aplicação do extrato bruto em veterinária

Abstract

Resumo: As bactérias do gênero Streptomyces têm sido muito estudadas pelo seu grande interesse industrial desde a sua descoberta como produtoras de antibióticos. A maioria das cepas de Streptomyces sintetiza substâncias antibacterianas, antifúngicas, antitumorais, antiparasitárias, herbicidas e enzimas usadas na medicina, agricultura e vários outros processos biotecnológicos. Neste trabalho procurou-se estudar o processo fermentativo da bactéria Streptomyces viridosporus T7A em resíduos agroindustriais, com o objetivo de aplicar o extrato bruto enzimático da fermentação na dieta de animais. Para tanto, o principal parâmetro analisado foi a produção de xilanase já que, no processo de degradação da fibra, outras enzimas, como a peroxidase, esterase e endoglucanase, podem estar sendo produzidas paralelamente. A primeira parte deste estudo envolveu a produção de xilanase em fermentação submersa, onde foram estudados diferentes substratos naturais, fatores físicos (pH, temperatura e taxa de inoculação) e fatores nutricionais (concentração do substrato; fonte de nitrogênio, hidroxietilcelulose, vitaminas do complexo B e os sais Na2HPO4, K2HPO4, MgSO4, NaCl, ZnSO4, FeSO4, CuSO4, MoSO4, MnSO4). Verificou-se que, utilizando o capim Napier a 1% (p/v), pH 8,6, temperatura de 37 0C, Na2HPO4.(0,0053 g/ml), taxa de inoculação de 12%, vitaminas do complexo B a 0,25% e hidroxietilcelulose 0,17%, obteve-se a melhor produção de xilanase (25 U/ml). O extrato bruto enzimático foi concentrado por ultrafiltração seguida de liofilização chegando-se a 2.272 U/g. Um segundo estudo foi realizado em fermentação no estado sólido (FES). Foram verificados os efeitos da composição do substrato (bagaço de cana, capim Napier e farelo de soja), da forma e taxa de inoculação, do tratamento térmico do substrato, da umidade e aeração sobre a produção de xilanase. Na FES, maiores níveis de atividade de xilanase, cerca de 450 U/g, foram obtidos com o substrato composto por 70% de bagaço de cana, 20% de capim Napier e 10% de farelo de soja e nas condições de 37 0C, pH 8,6, umidade acima de 90%, inoculado com suspensão de esporos a 107/g substrato. O escalonamento do processo de produção de xilanase foi realizado em biorreatores do tipo bandeja perfurada e tambor horizontal com agitação e aeração forçada. A atividade enzimática em biorreator do tipo bandeja e em tambor horizontal foi de 90 U/g e 80,5 U/g, respectivamente, o que mostra que este estudo deve ser continuado. O extrato bruto enzimático obtido por FES foi submetido a testes de atividade antimicrobiana, de inocuidade em cultivo celular e em camundongos, aplicado em dietas de frango para corte e em prova de digestibilidade in vitro para ruminantes. O extrato bruto enzimático apresentou efeito inibidor sobre cepas patogênicas Gram positivas (Staphylococcus aureus e Streptococcus sp.), porém não apresentou efeito sobre bactérias Gram negativas (Salmonella sp, e E. coli). O mesmo extrato mostrou ausência de toxicidade e efeito citoprotetor em cultivo celular e em camundongos, foi inócuo e teve influência no peso final nos grupos tratados. Já em frangos para corte a inclusão do extrato bruto não influenciou o ganho de peso, mas houve melhora na conversão alimentar (4,76%) em relação ao controle. Não houve diferença estatística entre o controle na digestibilidade in vitro da matéria seca, quando o extrato bruto foi adicionado nos níveis de 0,2;0,5; 2 e 5%.

Abstract: Since it was discovered for its antibiotic producing capacity, Streptomyces bacteria have been studied due to the great industrial interest on them. The majority of Streptomyces strains produces antibactericids, antifungic, antitumoral, antiparasital, herbicides substances and enzymes which are used in medicine, agriculture and other biotechnological processes. The aim of this work was to study the fermentative process of the Strepomyces viridosporus T7A using agroindustrys wastes and include the crude fermentation enzymatic extract in animal diet. The main parameter analysed was the xylanase production, however, other enzymes such as ligninperoxidase, esterase endoglucanase, are also produced. The first part of this study was conduced in submerged fermentation where the composition of natural substrates, fisical factors (pH, temperature and inoculation rate) and nutritional elements (substrate concentration; nitrogen, hidroxyetilcelulose, complex B vitamins, and minerals salts Na2HPO4, K2HPO4, MgSO4, NaCl, ZnSO4, FeSO4, CuSO4, MoSO4, MnSO4) were studied. It was verified that Napier grass 1% (w/v), soybean waste 1%, pH 8,6; temperature 37 0C; Na2HPO4 (0,0053 g/ml); 12% of inoculation rate, 0,25% of complex B vitamins and 0,17% of hidroxyetilcelulose were the best conditions for xylanase production which achieved 25 U/ml. The enzymatic extract was concentrated by ultrafiltration followed by liofilization reaching 2.272 U/g. The second part of the study was carried out using the solid state fermentation (SSF) technique, The effetc of the followin parameters were studied: substrate composition (sugar cane bagasse, Napier grass and soybean waste), form of inoculations and levels, thermic substrate pretreatment, moisture and aeration rate. In SSF the highest xylanase activity was reached with: 70 % sugar cane bagasse, 25% Napier grass and 10% soybean waste, 37 0C, pH 8,6, 90% of moisture and 107/g substrate. With these conditions the xylanase production achieve around 450 U/g. The scale-up of the xylanase production process was conducted in plates and horizontal drum bioreactors, reaching 90 U/g and 80,5 U/g, respectively. This fact shows the need for further studies of xylanase production in order to stablish better conditions for this process. The antimicrobian properties of the enzymatic extract was tested for toxicity on animals cell cultures, in mice, broiler chikens diet and digestibillity proof in vitro for ruminants. The enzimatic extract obtained by SSF showed inibitory effects on Gram-positive pathogenic bacteria strains (Staphylococcus aureus e Streptococcus sp.) but not on Gram negative bacteria strains (Salmonella sp, Pasteurella sp e E. coli), toxicity absence on cell cultures and mice, however a protector effect was verified and the final wheight was bigger on mice. In broiler chicken the crude extract inclusion did not influence the wheight gain, but had a good influence on feed conversion (4,76%), when comparated to control. No statistic difference in dry matter digestibility in vitro among control were verified, when the crude extract was added at 0,2;0,5; 2 and 5% levels.