Análise proteômica diferencial da raiz do trigo (Triticum aestivum VAR. LINI) CV. CD104 na ausência de nitrogênio e na presença da bactéria Herbaspirillum seropedicae SmR1

Abstract

Resumo: O nitrogênio (N) é limitante ao crescimento vegetal, tem influência na produtividade de cerais e é suprido com a utilização de fertilizantes nitrogenados. Entretanto os custos de produção e os problemas ambientais têm motivado os estudos de tecnologias alternativas ao uso do fertilizante. O emprego de microrganismos fixadores de nitrogênio em cereais, em especial para o trigo, tem sido estudado como uma das alternativas para o incremento de nitrogênio por características relacionadas à fixação ou à promoção do crescimento vegetal. Este trabalho teve como objetivo investigar proteínas presentes nas raízes da cultivar de trigo CD104 quando inoculadas com a bactéria H. seropedicae SmR1 na ausência de fonte de nitrogênio e carbono para compreender a fisiologia da planta e sua interação com a bactéria. Para tanto, sementes de trigo foram esterilizadas, pré-germinadas e transferidas para tubos de ensaio de vidro contendo meio de cultura MS líquido sem sacarose para obtenção do cultivo in vitro sob os tratamentos: com fonte de nitrogênio (CN), sem nitrogênio (SN) e sem nitrogênio com o inóculo da bactéria H. seropedicae SmR1 (SNI) adicionado aos tubos SN após 24 h da transferência das sementes para os tubos SN. Todos os tubos foram mantidos em sala de cultura a 25 °C e fotoperíodo de 14 h de luz por 20 dias. As raízes foram retiradas para avaliação do comprimento, massa seca e fresca, e para obtenção de extratos proteicos para análise proteômica por LC-MS/MS, tipo LTQ Orbitrap XL ETD. As imagens foram obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura de raízes intactas. Das proteínas, 1.069, foram identificadas seguindo critérios de restrições e comparadas com o banco de dados de proteínas UNIPROTKB de trigo e outros cereais. As informações sobre as vias metabólicas foram obtidas a partir de proteínas identificadas em cada tratamento, a partir de uma comparação de tratamentos emparelhados de proteínas exclusivas e mais abundantes. Observou-se que o comprimento, as massas e as vias metabólicas do tratamento SN foram mais distintas do CN e SNI. A proteína RUBISCO e outras como beta-1,3-glucanase e quitinases observadas no SNI sugerem atividade de fixação de carbono, respostas de hipersensibilidade e resistência a doenças em plantas promovidas pela bactéria. Um número muito baixo de bactérias endofíticas foi detectado. Um total de 211 proteínas exclusivas de H. seropedicae foram identificadas no tratamento SNI. As proteínas foram relacionadas à atividade de síntese, metabolismo de energia e carboidratos e atividade de fixação biológica de nitrogênio. Proteínas relacionadas ao metabolismo antioxidante, como a glutationa S-transferase, foram verificadas nas raízes do tratamento SN. Os resultados sugerem que as raízes do trigo na ausência de nitrogênio responderam a esta condição de estresse e, a presença promoveu respostas de estresse decrescentes à ausência de nitrogênio e algumas evidências de fixação biológica de nitrogênio na raiz.

Abstract: Nitrogen (N) is limiting plant growth, influences the productivity of cereals, and is supplied with nitrogen fertilizers. However, production costs and environmental problems have motivated studies in alternative technologies to the use of fertilizer. The use of nitrogen-fixing microorganisms in cereals, especially wheat, has been studied as one of the alternatives for increasing nitrogen in the plant and for characteristics related to fixing or promoting plant growth. The bacterium Herbaspirillum seropedicae SmR1 is a candidate for this purpose, as it interacts with several species of grasses, including wheat, leading to increased productivity. This study aimed to investigate proteins present in the roots of wheat cultivar CD104 when inoculated with the bacterium in the absence of nitrogen and carbon source to understand the physiology of the plant and its interaction with the bacteria. Wherefore, wheat seeds were sterilized, pre-germinated, and transferred to glass test tubes containing liquid MS culture media without sucrose to obtain in vitro cultivation under treatments: with nitrogen source (CN), without nitrogen (SN), and without nitrogen with the bacterium inoculum (SNI) added to SN tubes after 24 h of seed transfer to tubes of SN. All tubes were kept in a culture room at 25 °C and a photoperiod of 14 h of light for 20 days. The roots were taken for evaluation of length, dry and fresh mass, and to obtain protein extracts for proteomic analysis by LC-MS/MS, type LTQ Orbitrap XL ETD. Images were obtained by Scanning Electron Microscopy from intact roots. Proteins, 1069, were identified following criteria of restrictions and compared to the UNIPROTKB protein database of wheat and other cereals. Information on metabolic pathways was obtained from identified proteins in each treatment from a paired treatments comparison of exclusive and most abundant proteins. It was observed that the length, masses, and metabolic pathways of the SN treatment were more distinct from the CN and SNI. The RUBISCO protein and others as beta-1,3-glucanase and chitinases observed in SNI suggest the activity of carbon fixation, hypersensitivity responses, and resistance to diseases in plants promoted by the bacteria. A low number of endophytic bacteria were detected. A total of 211 exclusive proteins of H. seropedicae were identified in SNI treatment. Proteins were related to synthesis activity, energy and carbohydrate metabolism, and biological nitrogen fixation activity. Proteins related to antioxidant metabolism, as glutathione S-transferase, were verified in the roots of the SN treatment. The results suggest that wheat roots in the absence of nitrogen were responded to this condition and the presence, decreased responses to stress in the absence of nitrogen, and some pieces of evidence of biological nitrogen fixation in the root.