Avaliação dos efeitos biológicos da associação de branqueadores óticos ao vírus de poliedrose nuclear de Anticarsia gemmatalis Hubner (Lepidoptera: Noctuidae)

Abstract

Resumo: As investigações com substâncias associadas aos vírus de insetos, principalmente do gênero Nucleopolyhedrovirus, como estratégia para diminuir o tempo de mortalidade ou para contornar possíveis problemas de resistências incluem, entre outras, os branqueadores óticos derivados do ácido stilbene disulfônico. Esses produtos, utilizados ordinariamente em fábricas de sabão, detergentes, tintas e como branqueadores de fibras em geral, são utilizados, também, em técnicas biológicas envolvendo microorganismos. Recentemente, foi demonstrado o potencial desses branqueadores como protetores dos vírus de insetos contra a radiação ultravioleta (UV), bem como, o aumento da eficiência de alguns vírus utilizados como inseticidas microbianos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito biológico da associação de branqueadores óticos, disponíveis no mercado brasileiro, ao vírus de poliedrose nuclear (VPN) de Anticarsia gemmatalis Hübner (VPNMAg), e verificar a eficiência dessa associação nos hospedeiros, Spodoptera frugiperda (Smith) e Rachiplusia nu (Guenée) (Lepidoptera: Noctuidae). Inicialmente, foram avaliados onze branqueadores óticos na concentração de 0,5 % associados ao VPNMAg, em concentrações variando entre 10 corpos poliédricos de inclusão (CPI)/ml e 1,0 x 10 7 CPI/ml, verificando tanto o efeito na mortalidade de lagartas de A. gemmatalis quanto na proteção do vírus exposto durante 90 minutos à radiação UV. Dos branqueadores óticos usados, quatro que potencializaram o efeito do VPNMAg, todos derivados do ácido stilbene disulfônico (Tinopal UNPA-GX, Tinopal DMS, Leukophor DUB e BRY 10 D2 100), foram selecionados e avaliados em lagartas de A. gemmatalis suscetíveis e resistentes ao VPN e nos hospedeiros alternativos S. frugiperda e R. nu. Foram avaliados, ainda: o efeito do branqueador Tinopal DMS no número de corpos poliédricos de inclusão formados em A. gemmatalis, o efeito dos branqueadores óticos na preferência alimentar de A. gemmatalis, o peso das pupas formadas em dieta contendo branqueadores óticos e a implicação do Tinopal DMS na formulação do vírus de A. gemmatalis em substituição ao caulim, utilizado como material inerte na formulação desse vírus. A adição de Tinopal UNPA-GX a 0,5 % ao VPNMAg reduziu a concentração letal média (CL50) do vírus de A. gemmatalis de 7.811,3 CPI/ml para 53,9 CPI/ml, quando aplicado em lagartas do 2º instar, /.e., uma redução de 144,8 vezes; e reduziu a CL50 do VPN em 356,0 vezes em lagartas de 4° instar de A. gemmatalis. Entretanto, o maior efeito da associação de branqueadores óticos ao VPNMAg foi observado com lagartas resistentes ao vírus. Nesses insetos, a redução na CL50 foi de 61.667 vezes com o VPN associado ao Tinopal UNPA-GX a 0,5 %. Resultados similares foram observados com Tinopal DMS (37.000 vezes), BRY 10 D2 100 (60.656 vezes) e Leukophor DUB (10.000 vezes). Em todos os ensaios, a mortalidade dos insetos foi concentração-dependente. Na aplicação do VPNMAg, associado ao Tinopal DMS a 0,1 %, em plantas de soja, os resultados demonstraram que 3,0 x 10 10 CPI/ha, aproximadamente (um quinto) da dose utilizada para o controle de A. gemmatalis, a mortalidade aumentou de 16,5 % para 95 %. O tempo médio para ocorrer a mortalidade, ou tempo de mortalidade, (TM), avaliado com lagartas de A. gemmatalis inoculadas no 2º instar, foi reduzido em 27,1 % com o VPNMAg na concentração de 1,0 x 104 CPI/ml e associado ao branqueador Tinopal UNPA-GX a 0,5 %. Todos os branqueadores selecionados reduziram o TM na concentração de 0,5 %; na menor concentração dos branqueadores (0,1 %) apenas o Tinopal DMS diminui significativamente o TM. A associação dos branqueadores óticos ao VPNMAg aumentou a mortalidade de S. frugiperda e R. nu. O VPNMAg, na concentração de 1,0 x 105 CPI/ml, causou mortalidade de 17,1 % em R. nu e de 86,4 % quando associado ao Tinopal UNPA-GX. Nessa mesma concentração, o VPNMAg não foi infectivo a S. jrugiperda, mesmo associado aos branqueadores. Porém, na concentração de 1,0 x 107 CPI/ml, a mortalidade de S. frugiperda foi de 3.8 % e quando associado ao Tinopal UNPA-GX a mortalidade foi de 87,1 %. A exposição do VPNMAg à radiação ultravioleta, durante 90 minutos, reduziu a mortalidade de A. gemmatalis de 78,9 %, para 29,7 %. A mesma suspensão virai adicionada de alguns branqueadores óticos, e exposta à radiação UV, manteve o mesmo nível de mortalidade dos insetos após a exposição, variando entre 86,8 % com Leukophor DUB e 97,8 % com BRY 190 D2 100 e Tinopal UNPA-GX. Os testes de livre escolha demonstraram que a presença de branqueador na superfície do alimento provoca deterrência alimentar e o peso das pupas, formadas a partir de lagartas alimentadas em dieta contendo branqueador ótico na superfície, foi significativamente menor para o Tinopal UNPA-GX. Não houve diferença na mortalidade de lagartas de A gemmatalis quando o caulim, utilizado como material inerte nas formulações do VPNMAg, foi substituído pelo Tinopal DMS, porém, a dispersão do produto na água ocorreu mais facilmente com o vírus formulado com o branqueador. Os branqueadores óticos derivados do ácido stilbene disulfônico são substâncias, que do ponto de vista prático, apresentam grande potencial para serem associadas ao sistema VPNMAg- A. gemmatalis por diminuir a CL50 do VPN e o tempo de mortalidade do inseto hospedeiro. Além disso, a associação de branqueadores óticos ao VPNMAg pode permitir o controle de lagartas de A. gemmatalis altamente resistentes ao seu VPN, bem como aumentar o espectro de seus hospedeiros. Os branqueadores apresentam, também, grande potencial como material inerte nas formulações comerciais dos vírus de insetos.

Abstract: Several substances have been associated with insect viruses, mainly Nucleopolyhedrovirus, as a strategy to reduce time to kill the hosts or to counteract resistance, including the optical brighteners stilbene disulfonic acid derivatives. Optical brighteners are widely used in detergent, paper, dyes, plastic and organic coating industries and as a fluorochrome for microorganisms. Recently, the effects of brighteners to protect Nucleopolyhedrovirus against ultraviolet light, as well as to enhance some insect viruses efficacy were reported. The objectives of the current study were to evaluate the biological effects of Anticarsia gemmatalis Hubner nuclear polyhedrosis virus (AgMNPV) in combination with optical brighteners available in the Brazilian market and to verify their efficacy against the alternate hosts Spodoptera frugiperda (Smith) and Rachiplusia nu (Guende) (Lepidoptera: Noctuidae). A preliminary test was carried out with eleven optical brighteners at 0.5 % concentration (wt./vol. or vol./vol.) to evaluate the effect on A. gemmatalis mortality, as well as the effect of virus protection against the UV light, when the virus suspension was exposed to a germicidal lamp for 90 minutes. Four optical brighteners, among those that showed enhancement of AgMNPV, all stilbene disulfonic acid derivatives (Tinopal UNPA-GX, Tinopal DMS, Leukophor DUB and BRY 10 D2 100), were selected and evaluated in both susceptible and resistant A. gemmatalis insects, and in the alternative hosts S. frugiperda and R. nu. The following aspects were also evaluated: the number of polyhedral inclusion bodies (PIB) formed in A. gemmatalis caterpillars when Tinopal DMS was added to the AgMNPV; the effect of brighteners on A. gemmatalis feeding preference; the weight of pupae reared in diet that comprised the optical brighteners; and the effect of Tinopal DMS in the virus formulation substituting kaolin as an inert material. The addition of Tinopal UNPA-GX at a 0.5 % concentration to AgMNPV reduced the mean lethal concentration (LCso) from 7,811.3 PIB/mlto 53.9 PIB/ml, when applied against 2 nd-instar A. gemmatalis caterpillars, i., e., a LC50 reduction of 144.8-fold. For 4th-instar A. gemmatalis caterpillars the LC50 was reduced from 54,505.9 PIB/ml to 153.1 PIB/ml (356.0-fold). However, among selected brighteners, the relative increase in activity was much higher in the resistant insects than in the susceptible ones. In the former group, addition of 0.5 % Tinopal UNPA-GX to AgMNPV decreased the LC50 values from 3,7 x 10 7 PIB/ml to 6,0 x 10 2 PIB/ml (i.e., a reduction of6 1,666-fold). Similar results were observed with Tinopal DMS (37,000-fold), BRY 10 D2 100 (60,655-fold), and Leukophor DUB (10,000-fold). The effect of brighteners as an activity enhancer was concentration dependent. When Tinopal DMS was added to AgMNPV suspension, and applied to soybean plants at 3.0 x 10 10 PIB/ha (approximately one fifth of the recommended dosage to control A. gemmatalis), the mortality was enhanced from 16.5 % to 95 %. The mean time of mortality (TM) estimated for 2nd-instar A. gemmatalis larvae was reduced by "27 % when Tinopal UNPA-GX was added to the AgMNPV at 1.0 x 10 4 PIB/ml. All selected optical brighteners at a 0.5 % concentration reduced the TM; however, for the lowest optical brightener concentration (0.1 %), only Tinopal DMS reduced significantly the TM. The addition of 0.5 % optical brighteners to AgMNPV enhanced the mortality in the alternative hosts S. frugiperda and R. nu. The mortality of R. nu by AgMNPV alone at 1 . 0 x 10s PIB/ml was 17.1 %. When the virus was associated with Tinopal UNPA-GX, the mortality of R. nu larvae was 86.4 %. In the same concentration the AgMNPV did not cause S. frugiperda mortality even associated with optical brighteners. However, at the 1.0 x 107 PIB/ml AgMNPV concentration, the mortality o f S. frugiperda was 3.8 % by the virus alone, compared to 87.1 % when the virus was added to Tinopal UNPA-GX. Ultraviolet light (UV) radiation for 90 minutes reduced NPV-caused mortality of A. gemmatalis from 78.9 % to 29.7 %. The same viral suspension when associated to selected brighteners (Tinopal UNPA-GX, Tinopal DMS, Leukophor DUB, BRY 10 D2 100 e BRY 10 D2 150), and exposed to UV radiation, kept high levels of insect mortality, ranging from 86.8 % with Leukophor DUB to 97.8 % with BRY 10 D2 100 and Tinopal UNPA-GX. Free choice tests showed that the presence of optical brighteners onto the diet surface caused alimentary deterrence. However, apparently, this effect is more related to the texture of the diet than to its nutritional quality. The weight of pupae reared on diet with Tinopal UNPA-GX associated with AgMNPV was significantly lower than those reared on diet without optical brighteners. Like in the free choice tests, the texture of the diet surface might have been responsible for the lower insect development. There was no difference in the mortality of A. gemmatalis caterpillars when kaolin was replaced by Tinopal DMS as the inert material in the AgMNPV formulation. However, the dispersion in water was better with the brighteners than the original formulation. The results of the present work allowed to conclude that optical brighteners stilbene disulfonic acid derivatives are substances that show a great potential to be associated in AgMNPV-A gemmatalis system, because they reduce the LC50 of the virus and its time to kill the host. In addiction, the association of AgMNPV to the optical brighteners permits the control of highly resistant A. gemmatalis larvae, as well as enhances the mortality of alternative hosts. The optical brighteners also show a great potential as an inert material in commercial formulation of insect viruses.