Organização cromossômica de DNAs repetitivos no cariótipo de Pipa carvalhoi (Anura: pipidae)

Abstract

Resumo: A espécie Pipa carvalhoi (MIRANDA-RIBEIRO, 1937) pertence à família Pipidae, dentro do gênero Pipa que possui apenas dois cariótipos completamente descritos e estes apresentam uma variação cariotípica de 2n=22 (Pipa pipa) e 2n=30 (Pipa parva). Os espécimes de Pipa são os únicos representantes não africanos desta família, sendo que a separação das demais linhagens ocorreu devido ao evento vicariante da separação de Gondwana, onde o gênero Xenopus+Silurana permaneceu na região da atual África. As sequências repetitivas de DNA, em tandem e dispersas no genoma representam grande parte do genoma dos eucariotos e são componentes importantes na evolução cariotípica das espécies. O presente trabalho teve por objetivo realizar a descrição cariotípica da espécie de P. carvalhoi de populações da Bahia e Pernambuco, Brasil, bem como, analisar a organização de sequências repetidas em tandem (microssatélites, snoRNA U2 e histona H3), nos cariótipos de P. carvalhoi e X. tropicalis e dispersas no genoma (transposon de DNA hAT) no cariótipo de P. carvalhoi. Para a descrição do cariótipo foram utilizados métodos de coloração convencional, como giemsa, bandamento - C, coloração com fluorocromos e impregnação por nitrato de prata (Ag-NOR) e, para determinação da localização/organização das sequências de DNA repetitivo, foi utilizado o método de hibridização in situ fluorescente (FISH). O número diplóide de P. carvalhoi encontrado foi de 2n=20, possuindo pares metacêntricos (1, 4, 8), submetacêntricos (2 e 7), subtelocêntricos (3, 5, 6), e telocêntricos (9 e 10). Blocos de heterocromatina estão localizados principalmente nas regiões centroméricas dos cromossomos e a NOR foi detectada no cromossomo 9 deste cariótipo. Experimentos de FISH detectaram a presença de sequências teloméricas intersticiais (ITS), bem como clusters de U2 snRNA e histona H3, sendo estes dois últimos encontradas em posições conservados entre P. carvalhoi e X. tropicalis. Sondas de microssatélies (CA)15, (GA)15, (GATA)8, (CGC)10, (CAG)10, (GAA)10, (GACA)4, mapeadas em P. carvalhoi e Xenopus tropicalis, foram encontradas majoritariamente na região terminal dos cromossomos, com exceção de (CA)15 e (GA)15 em P. carvalhoi que foram encontrados mais em regiões centroméricas. Sondas de (GAA)10, (GACA)4 foram detectadas apenas em P. carvalhoi, o que indica um possível marcador cromossômico para essa espécie. Finalmente, foi detecatada pela primeira vez cópias do elemento genético móvel de classe II (transposons) da família hAT na espécie de P. carvalhoi. Os resultados deste trabalho descrevem o cariótipo e a organização cromossômica de algumas classes de DNAs repetitivos de P. carvalhoi, demonstrando que elementos como snoRNA U2 e histona H3 são conservados entre as espécies e podem vir a ser utilizados como marcadores cromossômicos para estudo de evolução cariotípica dentro deste grupo, ao passo que microssatélites se apresentaram de maneira distinta evidenciando a evolução destas sequências de maneira independente. A presença de ITS, ainda, parece não indicar rearranjo cromossômico, podendo ter surgido de maneira independente dentro deste grupo.

Abstract: The species Pipa carvalhoi (MIRANDA-RIBEIRO, 1937) belongs to Pipidae, within the Pipa genus that has only two completely described karyotypes and these present a karyotype variation of 2n=22 (Pipa pipa) and 2n=30 (Pipa parva). The specimens of Pipa are the only non-African representatives of this family, and the separation of the other lineages occurred due to the vicariant event of the separation of Gondwana where the genus Xenopus + Silurana remained in the region of present-day Africa. Repetitive DNA sequences in tandem and dispersed in the genome represent a large part of the eukaryotic genome and are important components in the karyotype evolution of the species. This study aimed to perform the karyotypic description of the P. carvalhoi species from Bahia and Pernambuco, Brazil, as well as to analyze the organization of repeated sequences in tandem (microsatellites, snoRNA U2, and histone H3) in the karyotypes of P. carvalhoi and X. tropicalis and dispersed in the genome (transposon of DNA hAT) into the P. carvalhoi karyotype. For the description of the karyotype, conventional staining methods such as giemsa, C - banding, fluorochrome staining, and silver nitrate impregnation (Ag-NOR) were used and, to determine the location/organization of the repetitive DNA sequences, fluorescence in situ hybridization (FISH) method was applied. The diploid number of P. carvalhoi found was 2n=20, with metacentric (1, 4, 8), submetacentric (2 and 7), subtelocentric (3, 5, 6), and telocentric (9 and 10) pairs. Heterochromatin blocks are located mainly in centromeric regions of chromosomes and the NOR site was detected on chromosome 9 of this karyotype. FISH experiments detected the presence of interstitial telomeric (ITS) sequences in P. carvalhoi and as clusters of U2 snRNA and histone H3 were found in conserved positions between P. carvalhoi and X. tropicalis. Microsatellite probes (CA)15, (GA)15, (GATA)8, (CGC)10, (CAG)10, (GAA)10, (GACA)4, mapped on P. carvalhoi and Xenopus tropicalis, were found predominantly in the terminal region of the chromosomes, except for (CA)15 and (GA)15 in P. carvalhoi that were found more in centromeric regions. Probes of (GAA)10, (GACA)4 were not detected only in P. carvalhoi, indicating a possible chromosomal marker for this species. Finally, copies of class II (transposons) mobile genetic element of the hAT family were detected for the first time in P. carvalhoi species. The results of this work describe the karyotype and the chromosomal organization of some classes of repetitive DNA of P. carvalhoi, demonstrating that elements such as snoRNA U2 and histone H3 are conserved among the species and can be used as chromosomal markers for study of karyotype evolution within this group, whereas microsatellites presented in a distinct way evidencing the evolution of these sequences independently. The presence of ITS does not appear to indicate chromosomal rearrangement and may have arisen independently within this group.