Approaches on in vitro organogenesis in 'delite' rabbiteye blueberry (Vaccinium virgatum Ait.) with morphological and anatomical aspects
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Data
2020Autor
Augusto, Carolina Smanhotto Schuchovski, 1974-
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Resumo: O mirtileiro é uma espécie frutífera perene e seus frutos apresentam propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. É convencionalm ente propagado vegetativamente, o que pode trazer muitos problemas fitossanitários. Uma alternativa seria o uso da propagação in vitro. Há muitos estudos em propagação e regeneração in vitro em espécies de mirtileiro, entretanto, a maioria está concentrada nas cultivares highbush e lowbush, e pouco nas cultivares rabbiteye, mais adaptadas ao clima subtropical. Portanto, há a necessidade de se pesquisar protocolos in vitro para este grupo de cultivares. O objetivo desta pesquisa foi estudar vários aspectos da m icropropagação e da organogênese de novo de brotos in vitro na cultivar 'Delite' do grupo rabbiteye de mirtilo. Nossos estudos foram organizados em três capítulos (i, ii e iii). Em cada um destes capítulos nosso objetivo foi: i) definir um protocolo de estabelecimento in vitro; ii) otim izar um protocolo de micropropagação, definindo os estágios de estabelecimento, multiplicação e enraizamento; iii) aperfeiçoar um método de regeneração adventícia de brotos in vitro e estudar o processo de desenvolvimento destes brotos. De acordo com os nossos resultados: i) no estabelecimento in vitro os tratam entos com zeatina foram superiores nas menores concentrações testadas (2,5 ^M); não houve diferenças nas combinações de sais com o meio WPM (Woody Plant Medium) modificado; e no meio WPM original, um aumento ou diminuição nas concentrações de NH4 NO3 e Ca(NO3)2 não levou ao aumento da eficiência no estabelecimento, e, em alguns casos, houve uma menor taxa de sobrevivência, form ação de brotos, ou tamanho dos brotos; ii) na micropropagação, o estabelecimento com imersão em hipoclorito de sódio por 5 min foi eficiente (96.7% explantes não contam inados) e o meio WPM com 2,5 ^M zeatina levou a uma taxa de 84.5% explantes com indução de brotação; a multiplicação com 2,5 ^M zeatina levou a uma taxa de 70% dos explantes proliferando novos brotos, e a posição dos explantes na vertical teve 100% de sobrevivência e 100% dos explantes proliferando novos brotos); o enraizamento in vitro com 500 mg L-1 IBA (ácido indolbutírico) levou a 100% sobrevivência e 100% de manutenção das folhas, com 37,5% de enraizamento; ou ainda, o enraizamento ex vitro em vermiculita com sais minerais do meio WPM, alcançando 88% de sobrevivência dos explantes, 86% dos explantes com a manutenção das folhas, 50% de indução de brotações e 68% de enraizamento. iii) uma alta taxa de regeneração (100% dos explantes, com 57 brotos/explante) no tratamento 0,5 ^M TDZ (thidiazuron); o uso da superfície adaxial do explante foliar em contato com o meio, com porções basal ou apical, mostrou boa regeneração (97%) e m aior número de brotos/explante (47.5). Foi observada a organogênese direta e indireta, com novos brotos form ando primórdios foliares com tecidos bem desenvolvidos, observados em microscopia óptica e eletrônica de varredura. Em conclusão, este estudo define um protocolo de micropropagação in vitro e regeneração adventícia de brotos em mirtileiro 'Delite' do grupo rabbiteye. Além disso, estes estudos podem ser usados para futuras pesquisas de cultura de tecidos in vitro, biotecnologia, conservação de germoplasma e m icropropagação mirtileiro. Palavras-chave: Ericaceae. Vaccinium virgatum. Micropropagação. Microscopia Eletrônica de Varredura. Microscopia Óptica. Abstract: Blueberry is a perennial fruit crop with antioxidant and anti-inflam m atory benefits, being recognized as a nutraceutical product. It is mainly vegetatively propagated, which can lead to phytosanitary issues. Therefore, an alternative method for traditional clonal propagation is in vitro culture. Although we found research on in vitro tissue culture in blueberry, most of this research focuses on highbush and lowbush groups. There are few works with rabbiteye cultivars, which are more suitable for subtropical climates. Therefore, there is a need to research in vitro protocols for this group of cultivars. The objective of this research was to study various aspects of micropropagation and de novo shoot organogenesis in vitro for 'Delite' rabbiteye blueberry. Our studies were organized into three distinct chapters (i, ii, and iii). In each of these chapters, we aimed to: i) develop an in vitro establishm ent protocol; ii) optimize a micropropagation protocol, defining the establishment, multiplication, and rooting stages; iii) improve an adventitious shoot regeneration method and study the developm ent process of these de novo shoots formed. According to the results: i) at in vitro establishment, zeatin was superior at the lowest (2.5 ^M ) concentration tested. In the combinations of salts with modified WPM (Woody Plant Medium) culture medium, no differences were reported. And an increase or decrease in NH4 NO3 and Ca(NO3)2 concentration in WPM did not improve the establishm ent efficiency, and, in some treatments, led to lower survival and shoot formation rates compared to the original WPM. ii) optimizing the micropropagation, the establishm ent with 5 min immersion in sodium hypochlorite revealed a good rate of uncontaminated explants (96.7%) and survival rate of the explants (96.7%), and WPM medium with 2.5 ^M zeatin led to high rates of survival (92.3%) and explants with axillary shoot growth (84.5%). Multiplication in the presence of 2.5 ^M zeatin led to a high percentage of explants proliferating new shoots (70%), and explants in the vertical orientation were efficient (100% survival, 100% explants with shoot proliferation, 1.8 new shoots formed/explant, with 5.1 cm and with 12.7 leaves/shoot). In vitro rooting with 500 mg L-1 IBA (indole-3-butyric acid) (100% survival and leaf maintenance, and 37.5% rooting), or ex vitro rooting in vermiculite with WPM (88% survival, 86% leaf maintenance, 50% bud induction, and 68% rooting) were the most efficient treatments. iii) A high rate of explants regenerating shoots (100%) was achieved at 0.5 ^M TDZ (thidiazuron), with 57 new shoots formed/explant. The use of adaxial surface touching the medium with apical or basal portion of the leaf showed good regeneration rates (97% explants regenerating shoots) and a high number of shoots formed (47.5 shoots/explant). Direct and indirect organogenesis were observed, and new shoots forming leaf primordia with well-developed tissues were described in light and scanning electron microscopy. In conclusion, this study defines protocols of micropropagation and in vitro adventitious shoot regeneration in 'Delite' rabbiteye blueberry. Beyond that, these findings can be used in further in vitro studies, as well as to improve biotechnological applications, germplasm conservation, and micropropagation in blueberry. Keywords: Ericaceae. Vaccinium virgatum. Micropropagation. Scanning Electron Microscopy (SEM). Light Microscopy.
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