Development of a standard control for a QPCR approach to quantify Leishmania loads and immune answer in animal model

Abstract

Resumo: A leishmaniose tegumentar é causada por um parasito intracelular obrigatório do gênero Leishmania, que afeta milhões de pessoas no mundo a cada ano. A falta de metodologia precisa para realizar a quantificação tem sido um obstáculo para medir a carga parasitária no tecido para diagnóstico ou para avaliar a eficácia do tratamento ou para avaliar possíveis candidatos a vacina. A reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) é um método alternativo, mais sensível que as técnicas parasitológicas convencionais. O objetivo deste estudo foi desenvolver ferramentas sensível e reprodutível para quantificação de carga parasitária em tecidos com base na tecnologia qPCR. Para realizar o objetivo na primeira etapa, selecionamos genes para quantificar a carga parasitária e, em seguida, desenvolvemos um padrão para quantificação da concentração entre diferentes espécies de Leishmania. Essas ferramentas foram avaliadas em ensaios intralaboratoriais, a sensibilidade foi determinada em 0,01 parasitos/?L e o método foi reprodutível com 100% de concordância entre os participantes. Os resultados mostraram que a especificidade do método identificou o gênero Leishmania e não apresentou reação cruzada com Trypanosoma cruzi ou DNA humano. Além disso, usamos esses parâmetros para avaliar um produto candidato à vacina desenvolvido pelo nosso grupo. A quantificação do parasito e a avaliação da resposta imune demonstraram que a mistura de peptídeos (P-1, P-2 e P-3) foi capaz de fornecer proteção de 77,8% para hamsters infectados experimentalmente com L. braziliensis. A eficácia foi suportada pela diminuição da carga parasitária no baço, pelo aumento do mRNA das citocinas do tipo Th1 (IFN-? e IL-12) e pela regulação negativa da IL- 10. Corroborando tais dados, houve um aumento no nível de IgG2a nos animais vacinados mostrando que o produto testado estimula o tipo de resposta Th1 e confere considerável proteção contra a leishmaniose cutânea experimental. Em conclusão, as ferramentas que desenvolvemos apresentaram uma alta eficiência para medir a carga parasitária em modelo animal, confirmando que elas podem ser usadas como ferramentas para diagnosticar e monitorar a infecção no processo de desenvolvimento de vacinas.

Abstract: Cutaneous leishmaniasis is caused by an obligate intracellular parasite of the genus Leishmania Ross, 1903 which affects million people worldwide each year. The lack of accurate methodology for quantification has been an obstacle to measure parasite load in tissue for diagnosis or to evaluate the efficacy of a vaccine. The realtime polymerase chain reaction (qPCR) is an alternative method, more sensitive than conventional parasitological techniques. The aims of this study developed tools to investigate a sensitive and reproducible method for parasite load quantification in tissues based on qPCR. To accomplish the objectives in the first step we selected genes to quantify the parasite load and then, we developed a standard for quantification the concentration between different Leishmania species. These tools were evaluated in intra-laboratory assays, the sensitivity was determined as 0.01 parasites/?L and the method is reproducibility with 100% of concordance between the participants. The results showed that the specificity of the method recognized the genus Leishmania and didn't show cross-reaction with Trypanosoma cruzi or Human DNA. Additionally, we use these tools to evaluate vaccine candidate product developed by our group. The parasite quantification and immune response evaluation demonstrated that the mix of peptides (P-1, P-2, and P-3) was able to provide considerable protection (77.8%) to hamsters experimentally infected with L. braziliensis. The efficacy was supported by the decreased of the parasite load in the spleen, by the increased of mRNA transcript of the Th1-type cytokines (IFN-? and IL- 12), and by downregulation of IL-10. This was further supported by a remarkable increase in IgG2a level. Therefore, it is inferred that the product tested stimulates Th1 response type and confers considerable protection against experimental cutaneous leishmaniasis. In conclusion, the tools here developed presented a high efficiency to measure parasite load in animal model confirming that they can be used as tools to diagnose and monitor the infection in the process of vaccine development