Novas evidências da participação das ficolinas e colectinas na interação frente a Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) infantum

Abstract

Resumo: A leishmaniose é uma doença negligenciada, relacionada com a pobreza e transmitida por flebotomíneos, apresenta duas principais formas clínicas: Leishmaniose Visceral (LV) e Leishmaniose Tegumentar (LT)/Cutânea (LC). Estima-se uma incidência de 0,7 a 1 milhão de casos novos de leishmaniose descritos anualmente em aproximadamente 100 países endêmicos. A Leishmania (Viannia) braziliensis (L. braziliensis), é um dos causadores da LC e o principal causador da leishmaniose mucocutânea (LMC), enquanto a Leishmania (Leishmania) infantum (L. infantum) é o agente causador da LV no Brasil. O sistema complemento compreende um conjunto de mais de 50 proteínas plasmáticas ou associadas às membranas com importante papel na resposta imune contra patógenos. A ativação do complemento gera mecanismos efetores chaves na resposta inata que inclui, opsonização de patógenos e complexos imunes, recrutamento de leucócitos e reações inflamatórias, além da lise celular. Existem três vias de ativação do complemento: clássica, alternativa e das lectinas. A via clássica é iniciada principalmente na presença de complexo antígeno anticorpo. A via alternativa tem seu início após a hidrólise espontânea do componente C3. A via das lectinas é ativada preferencialmente pelo reconhecimento de polissacarídeos presentes na superfície de microrganismos pelos componentes solúveis desta via, tais como a MBL, CL-11, CL-10 e ficolinas-1,-2,-3. Foi demonstrado que o complemento desempenha um papel crítico nos estágios iniciais da infecção por leishmanias. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ligação das proteínas iniciadoras da via das lectinas MBL, CL-11 e ficolinas-1,-2,-3 na superfície da L. braziliensis e da L. infantum. Formas promastigotas vivas na fase estacionária de crescimento foram incubadas com soro humano normal ou MBL, CL-11 e ficolinas-1,-2,-3 recombinantes e a ligação foi avaliada por microscopia confocal e citometria de fluxo. Foi observado que MBL, CL-11 e ficolinas-1,-2,-3 se ligam a L. braziliensis (ficolina-1>ficolina- 3>ficolina-2>CL-11>MBL). Ensaios de inibição revelaram que a manana é capaz de inibir completamente a ligação da MBL por microscopia confocal e que Nacetil- D-glucosamina diminui a intensidade de fluorescência na superfície das promastigotas da L. braziliensis em aproximadamente 20% por citometria de fluxo. Já com a L. infantum observou-se que MBL, CL-11, ficolina-1 e ficolina-3 interagem, porém, a ficolina-2 não. A afinidade de ligação das proteínas ao parasito demonstrou, MBL>ficolina-1>ficolina-3>CL-11. A interação do soro humano com a L. infantum levou a deposição dos fragmentos do complemento C3b e C4b na sua superfície, caracterizando ativação da via das lectinas. Nossos resultados demonstraram que as proteínas ativadoras da via das lectinas (MBL, CL-11 e ficolina-1,-2,-3), interagem distintamente com a L. braziliensis e L. infantum e indicam sua participação nas etapas iniciais da infecção. MBL, CL-11 e ficolinas-1,-2,-3 podem ser potenciais candidatas a modificadores da resposta imune inata na LC e LV e úteis na estratégia de desenhos de novas imunoterapias. Palavras-chave: L. braziliensis; L. infantum; MBL; CL-11; Ficolinas.

Abstract: Leishmaniasis is a neglected disease, related to poverty and transmitted by sandflies, has two main clinical forms: Visceral Leishmaniasis (VL) and Cutaneous Leishmaniasis (CL). It is estimated an incidence of 0.7 to 1 million new cases of leishmaniasis described annually in around 100 endemic countries. Leishmania (Viannia) braziliensis (L. braziliensis), is agent of CL and the main agent of mucocutaneous leishmaniasis (MCL), while Leishmania (Leishmania) infantum (L. infantum) is the causative agent of VL in Brazil. The complement system comprises more than 50 plasma or membrane-associated proteins with an important role in the immune response against pathogens. Complement activation generates key effector mechanisms in the innate response that includes, opsonization of pathogens and immune complexes, recruitment of leukocytes and inflammatory reactions, in addition to cell lysis. The complement system is activated by three pathways: classical, alternative and lectins. The classical pathway is initiated mainly by the presence of antigen antibody complex. The alternative pathway is activated by spontaneous hydrolysis of C3. The lectin pathway is preferably activated by the recognition of polysaccharides present on the surface of microorganisms by the soluble components of this pathway, such as MBL, CL-11, CL-10 and ficolins-1, -2, -3. Complement has been shown to play a critical role in the early stages of Leishmania infection. The objective of this study was to evaluate the binding of the lectin pathway activators MBL, CL-11 and ficolins-1, -2, -3 on the surface of L. braziliensis and L. infantum. Live promastigotes forms in the stationary growth phase were incubated with normal human serum or MBL, CL-11 and ficolins-1, -2, -3 recombinants and the binding was evaluated by confocal microscopy and flow cytometry. It was observed that MBL, CL-11 and ficolins-1, -2, -3 bind to L. braziliensis (ficolina-1> ficolina-3> ficolina-2> CL-11> MBL). Inhibition assays revealed that mannan is able to completely inhibit MBL binding by confocal microscopy and N-acetyl-Dglucosamine decreases the fluorescence intensity on the surface of L. braziliensis promastigotes in around 20% by flow cytometry. With L. infantum, it was observed that MBL, CL-11, ficolin-1 and ficolin-3 interact, however, ficolin-2 does not. The protein-binding affinity for the parasite demonstrated MBL> ficolin- 1> ficolin-3> CL-11. The interaction of human serum with L. infantum led to the deposition of fragments of complement C3b and C4b on its surface, characterizing the lectin pathway activation. Our results demonstrated that the activators proteins of the lectin pathway (MBL, CL-11 and ficolin-1, -2, -3), interact distinctly with L. braziliensis and L. infantum and indicate their participation in the initial steps of infection. MBL, CL-11 and ficolins-1, -2, -3 could be potential candidates for innate immune response modifiers in CL and VL and useful in the strategy of designing new immunotherapies. Keywords: L. braziliensis; L. infantum; MBL; CL-11; Ficolins.