Desenvolvimento de antígenos recombinantes para imunodiagnóstico de HTLV-1 e 2

Abstract

Resumo: O HTLV-1 é o agente etiológico da leucemia / linfoma de células T do adulto e paraparesia espástica tropical, também conhecida como mielopatia associada ao HTLV. A associação de infecções por HTLV-2 com doenças neoplásicas ainda não foi claramente estabelecida. Ambos são retrovírus com um genoma de RNA compreendendo os seguintes genes: gag que codifica as proteínas da matriz, capsídeo e nucleocapsídeo; env, codificando as proteínas do envelope viral; pol, codificando a transcriptase reversa e; o gene pX que codifica proteínas reguladoras. A resposta inicial dos anticorpos à infecção pelo HTLV é direcionada às proteínas estruturais codificadas pelos genes gag e env. A maioria dos testes de diagnóstico é baseada na detecção de anticorpos que reconhecem essas proteínas. Não existe tratamento de cura completa ou vacina neutralizadora para infecções por HTLV. Portanto, o diagnóstico precoce é de extrema importância para o controle epidemiológico em regiões endêmicas e para o tratamento de indivíduos infectados. No Brasil, há uma necessidade de incentivo para a produção local de ensaios de diagnóstico, como os testes de diagnóstico utilizados para monitorar sangue para transfusão e redes de atenção primária à saúde. Esses testes geralmente são importados, o que aumenta os custos de triagem e diagnóstico confirmatório para esta infecção. Neste trabalho, as sequências completas ou regiões imunogênicas das proteínas p19, p24, gp21, gp46 do HTLV-1 e 2 foram clonadas nos vetores de expressão de Escherichia coli e expressas com sucesso como proteínas únicas ou quiméricas. Um total de nove antígenos HTLV-1 e cinco HTLV-2 foram produzidos compreendendo diferentes regiões imunogênicas desses vírus. Entre esses antígenos, apenas as construções antigênicas HTLV-1 Ag 2-4, Ag 2-12, Ag 2-13 e Ag 2-16 e o HTLV-2 A g3-3 e Ag 3-4 foram expressos na fração solúvel. Os antígenos restantes foram solubilizados a partir de corpos de inclusões usando ureia. Todos os antígenos purificados foram avaliados em ensaios por ELISA com amostras de soro positivas para HTLV em paralelo com um conjunto de amostras de controle negativo. Três antígenos do HTLV-1 atingiram índices de sensibilidade e especificidade de 98% ou mais. Um antígeno HTLV-2 mostrou um valor de sensibilidade de 100% e especificidade de 95,7%. As amostras de soro, no entanto, não foram genotipadas, de modo que não foi possível avaliar a correlação entre a eficiência do antígeno e o tipo de HTLV. No entanto, estes dados mostraram que esses dois vírus dificilmente podem ser diferenciados com base em imunoensaios. Poucos antígenos recombinantes do HTLV-1 mostraram reação cruzada com soros HIV positivos, enquanto o HTLV-2 mostrou uma extensão significativa da reação cruzada com soros HIV. Em conclusão, a eficiência demonstrada por esses antígenos demonstra seu potencial de utilização em ensaios para triagem de sangue para transfusão e para rede de atenção primária à saúde. Palavras-chave: antígenos recombinantes; HTLV1/2; imunodiagnóstico

Abstract: HTLV-1 is the etiological agent of adult T-cell leukemia/lymphoma and tropical spastic paraparesis, also known as HTLV-associated myelopathy. Association of HTLV-2 infections with neoplastic diseases have not been clearly established yet. Both are retroviruses with an RNA genome comprising the following genes: gag that encodes the matrix, capsid, and nucleocapsid proteins; env, encoding the viral envelope proteins; pol, encoding the reverse transcriptase and; the pX gene encoding regulatory proteins. The initial antibody response upon HTLV infection is directed towards the structural proteins encoded by the gag and env genes. Most diagnosis tests are based on the detection of antibodies that recognize these proteins. There is no complete cure treatment or neutralizing vaccine for HTLV infections. Therefore, early diagnosis is of extreme importance for epidemiological control in endemic regions and for treatment of infected individuals. In Brazil, there is a need and incentive for local production of diagnostic assays, such as the diagnostic tests used to monitor blood for transfusion and primary health care networks. These tests are usually imported, which adds up to the costs for screening and confirmatory diagnosis for this infection. In this work, the complete sequences or immunogenic regions of HTLV-1 and 2 proteins p19, p24, gp21, gp46 were cloned into Escherichia coli expression vectors and successfully expressed as single or chimeric proteins. A total of nine HTLV-1 and five HTLV-2 antigens were produced comprising different immunogenic regions of these viruses. Among these antigens, only the HTLV-1 Ag2-4, Ag2-12, Ag2-13 and Ag2-16 antigenic constructs and the HTLV 2 Ag3-3 and Ag3-4 were expressed in soluble fraction. The remaining antigens were solubilized from inclusions bodies using urea. All purified antigens were evaluated in ELISA assays with HTLV-positive serum samples in parallel with a set of control samples. Three HTLV-1 antigens reached sensibility and specificity indexes of 98% or higher. An HTLV-2 antigen showed a sensibility value of 100% and specificity of 95,7%. The serum samples, however, have not been genotyped so that a correlation between antigen efficiency and HTLV type could not be evaluated. However, these data shown that these two viruses can hardly be differentiated based on immunoassays. The HTLV-1 antigens showed no cross reaction with HIV positive sera whereas the HTLV-2 showed a significant extent of cross reaction with HIV sera. In conclusion, the efficiency shown by these antigens demonstrates their potential for utilization in assays to screen blood for transfusion and for primary health care network. Keywords: recombinant antigens; HTLV1 / 2; immunodiagnosis.