Inativação fotodinâmica in vitro promovida por derivados porfirínicos catiônicos em colletotrichum lindemuthianum e colletotrichum truncatum

Abstract

Resumo: A produção de grãos no Brasil representa um dos pilares da agricultura no país, atingindo níveis de 178 milhões de toneladas na última safra. Dentre as culturas, se destacam o feijão, característico da alimentação brasileira e a soja, aplicada na alimentação humana e em processos industriais. Perdas na produção podem ser geradas por doenças, como a antracnose, que é causada por Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) em feijão e Colletotrichum truncatum (Schwein.) em soja e pode proporcionar destruição total das culturas quando existem condições adequadas para esses patógenos. As estratégias de controle não são totalmente eficientes devido à variabilidade genética mostrada pelos micro-organismos e por sua alta capacidade de sobrevivência no meio ambiente. Além disso, os danos à saúde pública e ao meio ambiente causados pelos fungicidas demandam a busca por ferramentas auxiliares para controle da doença. Por essa razão, a Inativação Fotodinâmica (IFD) pode representar uma alternativa. A metodologia utiliza a associação entre um fotossensibilizador, luz e oxigênio e objetiva a destruição seletiva de determinado alvo biológico, como microorganismos. Dentre os fotossensiblizadores empregados estão as porfirinas e seus derivados, especialmente aqueles contendo cargas positivas em sua estrutura química, que mostraram eficientes resultados quando aplicados na IFD. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a eficiência desta técnica in vitro utilizando cinco derivados porfirínicos catiônicos estruturalmente relacionados (Mono-Py+, Ditrans- Py+, Di-cis-Py+, Tri-Py+ e Tetra-Py+) em conídios de Colletotrichum lindemuthianum e Colletotrichum truncatum, assim como determinar a Concentração Letal 50% (CL 50) e Concentração Letal 90% (CL 90) para os diferentes derivados e avaliar a interação entre esses e os micro-organismos. Com esse propósito, os experimentos foram realizados empregando suspensões de conídios quantificadas em 105 conídios.mL-1. As concentrações dos fotossensibilizadores foram inferiores a 2,0 mol.L-1 com fluência de 90 J.cm-2. Além dos ensaios de IFD, três tipos de experimentos controles foram executados simultaneamente: controle claro, controle escuro e branco. A CL50 e CL90 foram determinadas de acordo com a curva de IFD empregando equação da reta correspondente. A interação entre os fitopatógenos e as porfirinas foi verificada por meio de avaliação por espectrofluorimetria e microscopia de fluorescência. Todos os derivados foram capazes de promover a inativação significativa in vitro de conídios de Colletotrichum lindemuthianum e Colletotrichum truncatum. Os derivados que mostraram os menores valores de CL50 e CL90 em relação a ambos os fitopatógenos foram aqueles com duas cargas positivas, Di-trans-Py+ e Di-cis-Py+. Não foram evidenciadas diferenças significativas entre os controles avaliados, indicando que a inativação ocorreu devido à IFD e não aos seus componentes isoladamente. A interação entre os patógenos e as porfirinas foi variável e pode ser relacionada à estrutura química e ao número de cargas positivas presentes nos derivados. Os resultados promissores da IFD in vitro empregando porfirinas catiônicas em conídios de Colletotrichum lindemuthianum e Colletotrichum truncatum devem ser comparados no futuro com ensaios in vivo para avaliar aplicação da IFD como auxiliar no controle da antracnose no Brasil. Palavras-chave: Colletotrichum lindemuthianum. Colletotrichum truncatum. Inativação fotodinâmica. Porfirinas catiônicas.

Abstract: Grain production represents one of the pillars of the Brazilian agriculture, which have reached 178 million tons in the last harvest season. Among the agricultural products, beans are one of the most important Brazilian food and soybean is applied in human food and industrial processes. Losses in production can be generated by diseases as anthracnose, which is caused by Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) in beans and Colletotrichum truncatum (Schwein.) in soybean. These microorganisms can cause total losses of crops when there are adequate conditions for them. Control strategies are not completely efficient due to the genetic variability shown by the microorganisms and their survival on the environment. In addition, damage to human health and the environment caused by fungicides require the search of different methods in order to control the disease. For this reason, Photodynamic Inactivation (PDI) may represent an alternative for microorganism control. The methodology uses the association between a photosensitizer, light and oxygen, which aims the selective destruction of a specific biological target, such as microorganisms. Porphyrins and their derivatives (especially those containing positive charges in their chemical structure) are photosensitizers that showed efficient results when applied to the PDI. The aim of the present study was to evaluate the efficiency of in vitro PDI using five structurally related cationic porphyrin derivatives (Mono-Py+, Di-trans-Py+, Di-cis-Py+, Tri-Py+ and Tetra-Py+) in conidia of Colletotrichum lindemuthianum and Colletotrichum truncatum, as well as to determine the lethal concentration for 50% and 90% of conidia (LC50 and LC90) for the different derivatives and to evaluate the interaction with the microorganisms. For this purpose, the experiments were carried out using conidial suspensions containing 105 conidia. mL-1. The concentrations of the photosensitizers were less than 2.0 mol.L-1 and a fluence of 90 J.cm -2. In addition to the PDI assays, three types of control experiments were performed simultaneously: light control, dark control and blank. The LC50 and LC90 were determined according to the PDI curve employing correspondent linear regression. The interaction between phytopathogens and porphyrins was verified by spectrofluorimetry and fluorescence microscopy. All derivatives were able to promote the significant inactivation of Colletotrichum lindemuthianum and Colletotrichum truncatum conidia in vitro. The derivatives that showed the lowest values of LC50 and LC90 in relation to both phytopathogens were those with two positive charges, Di-trans-Py+ and Di-cis-Py+. There were no significant differences among the evaluated controls, indicating that the inactivation occurred due to PDI and not to its components alone. The interaction between the microorganisms and the porphyrins was variable and can be related to the chemical structure and the number of charges of derivatives. The promising results of in vitro PDI employing cationic porphyrins in conidia of Colletotrichum lindemuthianum and Colletotrichum truncatum should be compared in the future with in vivo assays to evaluate the application of PDI as an aid in the control of anthracnose in Brazil. Key-words: Colletotrichum lindemuthianum. Colletotrichum truncatum. Photodynamic Inactivation. Cationic porphyrins.