Desenvolvimento e validação de método para quantificação da hemoglobina glicada por LC-QTOF-MS

Abstract

Resumo: A hemoglobina glicada (HbA1c) é o atual biomarcador de referência para monitorar o controle e diagnóstico do diabetes, pois é capaz de fornecer informações dos níveis glicêmicos a longo prazo. Valores elevados de HbA1c estão associados à muitas complicações do diabetes. Devido a sua importância clínica, vários métodos foram desenvolvidos para a quantificação de HbA1c, utilizando diferentes princípios. Porém, dependendo do método utilizado, os resultados podem variar, podendo gerar dúvidas quanto ao diagnóstico e controle da doença. Nesse sentido, há necessidade de se investir no desenvolvimento de métodos utilizando técnicas modernas, que sejam mais precisos e exatos. Desta forma, este trabalho visou desenvolver e validar um método por cromatografia liquida de ultra eficiência acoplada a espectrometria de massas de alta resolução para quantificação da hemoglobina glicada em sangue humano. Para o desenvolvimento do método, amostras de sangue foram coletadas, centrifugadas e o plasma descartado. As células restantes foram tratadas para análise e hemolisadas com 1 mL de água milli-Q. Alíquota contendo 0,5 mg de hemoglobina foi submetida a digestão enzimática, utilizando Glu-C e tripsina. Para cada alíquota foram adicionados 50 ?L de solução da enzima selecionada e tampão, em quantidade necessária para atingir volume final de 500 ?L. A mistura foi mantida a 37°C durante 18 horas. Após o período de digestão, as amostras foram congeladas a -40°C por 12 horas e então descongeladas, diluídas e injetadas no UPLC-QTOF-MS. As análises foram realizadas utilizando o cromatógrafo UPLC Acquity H-Class Waters Co. Ultra Performance acoplado ao espectrômetro de massas hibrido Quadrupolo - Tempo de voo (Xevo G2-S), com fonte de ionização por electrospray, operado no modo positivo de ionização. Os peptideos VHLTPE m/z 695,373 e glu-VHLTPE m/z 857,426, obtidos via digestão por glu-C, foram selecionados para a quantificação de HbA1c (%), representando a porção N-terminal da cadeia beta. A separação cromatográfica foi obtida em coluna Acquity UPLC ® BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 ?m), mantida a 40°C. A fase móvel foi composta por água (A) e acetonitrila (B), ambas contendo 0,02% de TFA e 0,1% de ácido acético, eluídos em modo gradiente. O fluxo foi de 0,50 ml/min e o volume de injeção foi de 5 ?L. O método desenvolvido foi capaz de detectar hemoglobina glicada no sangue humano, via análise de peptídeos, com alta resolução de massa e sem interferência de matriz. O método foi totalmente validado, sendo considerado linear na faixa de 4,4% a 11,9% de HbA1c, sensível, seletivo, preciso, exato e livre de efeitos residuais e de matriz. O método foi aplicado com sucesso em amostras de 15 pacientes com diabetes, alcançando cerca de 90% de concordância com os resultados do método de referência. O método desenvolvido forneceu informações precisas e exatas sobre a massa do peptídeo, sem preparação laboriosa da amostra. Estes resultados sustentam o uso desta técnica para melhorar a qualidade dos resultados da hemoglobina glicada nos serviços de saúde e demonstram uma possível aplicação da investigação de peptídeos para análises clínicas em um futuro próximo. Palavras chave: hemoglobina glicada, peptídeos, cromatografia, espectrometria de massas.

Abstract: Glycated hemoglobin (HbA1c) is the current gold standard biomarker to monitor the diabetes control, representing long-term plasma glycemic levels. It has been associated with many complications of diabetes. Due to its clinical importance, several methods were developed for HbA1c quantification, using different principles. Most of them are based on the charge difference between HbA1c and HbA0, such as affinity chromatography and immunochemical methods. The results obtained with these techniques may differ according to the method adopted; hence, there is a great need and effort to standardize the current methods to quantify glycated hemoglobin. New methods, with the aid of modern techniques, faster and more accurate, should be developed. On this way, this work aims to develop and validate a UPLC-QTOFMS method for quantification of glycated hemoglobin in human blood. The blood samples were collected, centrifuged and the plasma was discarded. The remaining cells were treated for analysis and hemolyzed with 1 mL of milli-Q water. An aliquot containing 1 mg of total hemoglobin was taken to enzymatic digestion. Glu-C and trypsin were evaluated as digestion enzymes. To each aliquot was add 50 ?L of selected enzyme solution and completed to a final volume of 500 ?L with adequate buffer. The mixture was maintained at 37°C for 18 hours. After the period of digestion, the samples were frozen at -40°C thawed, diluted and injected on UPLCQTOF- MS. Analyzes were performed using Ultra Performance Liquid Chromatography Acquity H-Class Waters Co. (Milford, USA) coupled to mass spectrometry Quadrupole - Time of Flight (Xevo G2-S, Waters, Milford, USA), provided with electrospray ionization source (ESI) operated in the positive ion mode. VHLTPE m/z 695.373 and glu-VHLTPE m/z 857.426, obtained via glu-C digestion, were the selected peptides to quantification of HbA1c (%), representing the Nterminal of beta chain. Chromatographic separation was obtained in an Acquity UPLC ® BEH C18 column (50 x 2.1 mm, 1,7 ?m), maintained at 40°C. The mobile phase was composed of water (A) and acetonitrile (B), both containing 0.02% TFA and 0.1% acetic acid; eluted in gradient mode. The flow rate was 0.50 mL/min and the injection volume was 5 ?L. The developed method was capable of detect hemoglobin and glycated hemoglobin in human blood, via peptide analyzes, with high mass resolution and no matrix interference. The method was fully validated, being considered linear in the range of 4.4% to 11.9% of HbA1c, sensitive, selective, precise, accurate and free of matrix and carryover effects. The method was successfully applied to real samples from 15 patients with diabetes, reaching about 90% of agreement with reference method results. provided accurate and precise information on peptide mass, without laborious sample preparation. These results support the use of this technique to improve the quality of results of glycated hemoglobin in health services and demonstrate a possible application of peptide investigation for clinical analysis in the near future. Keywords: Glycated hemoglobin, peptide, chromatography, mass spectrometry