Isolamento e caracterização dos simbiontes do tripanossomatídeo Crithidia deanei : 1 - caracterização da síntese de proteínas e ácido nucléico; 2 - clonagem molecular de genes

Abstract

Resumo: Neste trabalho nós descrevemos um método de isolamento de simbionte de Crithidia deanei em gradiente de Percoll. Este método permite o isolamento de simbiontes intactos em quantidade suficiente para se efetuar estudos bioquímicos. O flagelado Crithidia deanei foi rompido por sonicação e os simbiontes liberados foram separados por gradiente descontínuo de Percoll dos restos celulares e de células de Crithidia deanei que não se romperam pelo processo de ultrassom. Os simbiontes isolados pelo método citado acima conservam as suas características morfológicas e apresentam ainda uma atividade metabólica intensa. A enzima ornitina carbamil transferase (OCT), foi utilizada como marcador bioquímico dos simbiontes. Esta enzima encontra-se com atividade enzimática três vezes maior na fração do gradiente de Percoll aonde se encontram os simbiontes isolado do que no extrato bruto, e aproximadamente 6 % da atividade total da OCT do extrato bruto foi recuperada na fração rica em simbiontes do gradiente de Percoll. Nós estimamos que 20 % dos simbiontes presentes no homogenato foram recuperados nesta fração. Os simbiontes isolados pelo gradiente de Percoll incorporaram L-(4-5-H) leucina e L-(S) metionina ativamente nos primeiros 45 e 60 minutos respectivamente. O mecanismo de síntese proteica do simbionte foi analisada através do efeito dos antibióticos cloranfenicol e rifampicina na incorporação com L-(4-5-H) leucina nas suas proteínas Os antibióticos cloranfenicol e rifampicina em concentração de 20 (jg/ml diminuem a incorporação entorno de 50 % e 70%, respectivamente. Estes antibióticos em concentração de 50 ug/ml inibem a incorporação quase completamente. A inibição da síntese proteica pelos antibióticos cloranfenicol e rifampicina produzem evidências díiretas da existência de um mecanismo de síntese proteica procariótica. Os polipeptídeos sintetizados pelo simbiontes foram marcados com L-( S) metionina e submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS. Os polipeptídeos fortemente marcados apresentaram pesos moleculares aparentes de 90, 88, 78, 60 e 58 x 10.0 perfil dos polipeptídeos sintetizados pelo simbionte difere daqueles polipeptídeos encontrados na cepa de Crithidia deanei com simbionte. Vários polipeptídeos estão ausentes ou fracamente marcados no flagelado, por exemplo 88,78,60 e 58 kDa .Este resultado sugere que a síntese destes polipeptídeos está inibida no flagelado intacto. A incorporação de metil ( H )-timidina na fração ácido insolúvel dos simbiontes foi linear até 35 minutos, demonstrando que o simbionte isolado sintetiza DNA. Este resultado sugere a presença de uma via alternativa de síntese de DNA e a depencia de tiraidina quinase nesta via. A integridade do DNA do simbionte isolado foi analisada em eletroforose de gel de agarose. Este comigra com o DNA de E.coli em uma simples banda, cujo o peso molecular está acima do marcador de massa molecular 23 Kb. O DNA do simbionte foi digerido com enzimas de restrição Mbo I, obtendo-se fragmentos de 2,3-1 Kb que foram clonados em plasmídio pUC 13 . O banco construído em pUC 13 com DNA do simbionte de Crithidia deanei é representativo. Os Clones contendo sequências específicas de endosimbiontes foram isolados por hibridização diferencial.

Abstract: The method described here allows the isolation intact symbionts in sufficient amounts for biochemical studies. The flagellates are disrupted by sonication and the symbionts separated from unbroken cells and cellular debris by centrifugation through a discontinous Percoll gradient. The isolated symbionts retain their characteristic morphological features and were reasonably free of subcellular debris. Ornithine carbaomoyltransferase (OCT) a symbiont enzymatic marker is present in the symbiont fraction with a specific activity 3 fold higher than in crude homogenates. We estimate that about 20 % of symbionts present in the homogenate are recovered in this fraction. The isolated symbionts actively incorporate L-(4-5-H)-leucine and L-(S) methionine into acid-insoluble material for the first 45 and 60min, respectively. In order to characterize the protein-synthesis machinery operanting in the symbionts, have studied the effects of chloramphenicol and rifampicin on the incorporation of leucine into proteins. Chloramphenicol and rifampicin at 20 ug/ml reduce the incorporation by about 70 and 50%, respectively. Both antibiotics at 50 ug/ml almost completely inhibited the incorporation L-(4-5-H) leucine. The inhibition of protein synthesis by chloramphenicol and rifampicin provides direct evidence for the existence of a prokaryotic protein-synthesizing system in this unusual subcellular structure. The labeled polypeptides synthesized by the isolated endosymbionts range between 200,000-18,000, as determined by SDS-polyacrilamide gel electrophoresis. The most heavily-labeled polypeptides are those with apparent molecular weight of 90, 88, 78, 60 and 58 x 10. The profile of symbiont labeled polypeptides differs from that obtained with the symbiont strain C. deanei. Several symbiont polypeptides are absent or poorly represented in the flagellate, for example, the 88, 78, 60, and 58 kDa polypeptides, suggesting that synthesis of these polypeptides is inhibited in the intact flagellate. The incorporation metil-(H) thymidine into acid insoluble symbiont fraction was linear up to 45 min showing that isolated symbionts can synthesize DNA. This result suggests the presence in the symbionts of a thymidine kinase dependent salvage pathway for DNA synthesis. The integrity of the DNA extracted from isolated symbiont was analyzed by agarose gel electrophoresis. lt comigrates with intact E. coli DNA as a single heavy band. The symbiont DNA has been purified and fragment with restriction endonuclease Mbo I. The fragments (2,3-1,0 Kb) have been incorporated in vitro into pUC 13 to make libraries which most of the endosymbiont DNA is represented. Specific endosymbiont sequences can be isolated in this library by differential screening.