Determinação do controle de qualidade da proteína prion celular : envolvimento da proteína chip

Abstract

Resumo: A proteína prion celular, ou PrPC, é uma glicoproteína extracelular, ancorada na membrana por uma molécula de glicofosfatidilinositol e expressa abundantemente no sistema nervoso central. A conversão de PrPC para uma isoforma mal dobrada e infecciosa, PrPSc, é responsável pelo desenvolvimento das doenças espongiformes transmissíveis (TSEs) ou doenças priônicas. Em trabalhos anteriores do nosso grupo foi identificada a interação entre PrPC e Stub1 (STIP1 homology and U-Box containing protein 1), através do sistema de duplo-híbrido em leveduras. Stub1 ou CHIP (C-terminus of HSC70-interacting protein) é uma co-chaperona citoplasmática que apresenta atividade ubiquitina E3-ligase que realiza a triagem de proteínas para o dobramento ou degradação e participa de seu controle de qualidade. A interação entre PrPC e CHIP foi confirmada através de técnicas de pull-down e co-imunoprecipitação. Através de ensaios de degradação, indicamos que PrPC é uma proteína cliente de CHIP, pois esta provoca ubiquitinação em PrPC. O presente trabalho teve como objetivo principal esclarecer em maiores detalhes a participação de CHIP no controle de qualidade de PrPC. Através de experimentos de pull-down, foi visto que a fração N-terminal de PrPC não é primordial para que aconteça sua ligação com CHIP, nem com Hsp90 ou STI1, o que sugere que essas interações ocorram pela região C-terminal de PrPC. Através de experimentos de silenciamento de CHIP e com o uso de uma linhagem celular nocauteada para essa proteína, foi visto que CHIP é capaz de degradar PrPC. Além disso, experimentos de ubiquitinação sugeriram que a via envolvida nessa modulação seria a via de ubiquitina-proteassomo. Se a conversão de PrPC para PrPSc depender desse controle de qualidade, CHIP apresenta-se como um alvo potencial para abordagens terapêuticas nas doenças causadas por prions. Portanto, outro enfoque deste projeto foi investigar se CHIP estaria envolvida na degradação de formas de PrP citosólicas (CytPrP), já que há várias evidências que indicam que essas formas são tóxicas para determinados tipos celulares. O nosso grupo já mostrou que, em ensaios de viabilidade celular, o aumento da expressão CHIP reverte esses efeitos tóxicos de CytPrP No presente trabalho, tentou-se compreender melhor o mecanismo de proteção de CHIP. Quando utilizamos um plasmídeo capaz de expressar uma forma citosólica de PrP (Cyt-PrP), não foi possível detectar uma interação entre essa forma de PrP e CHIP em ensaios de co-imunoprecipitação. Além disso, Cyt- PrP não foi capaz de ser degradado ou sofrer ubiquitinação por CHIP. Assim é possível que CHIP haja indiretamente sobre essa forma tóxica de PrP ou desempenhe sua atividade de chaperona para exercer o efeito protetor observado. Uma vez que a caracterização do processamento de PrPC ajuda no entendimento das patologias causadas por prions, esse trabalho poderá auxiliar na evolução de estratégias de tratamento para as TSEs, tendo CHIP como alvo. Palavras-chave: PrPC. CHIP. Prion citosólico. Controle de qualidade de PrPC.

Abstract: Cellular prion protein, or PrPC, is an extracellular glycoprotein, attached to the cell membrane through a glycophosphatidylinositol molecule and mostly expressed in the central nervous system. The conversion of PrPC to a misfolded and infectious isoform, PrPSc, is responsible for the development of spongiform transmissible encephalopathies (TSEs) or prion diseases. In previous works of our group, we identified the interaction between PrPC and Stub1 (STIP1 homology and U-Box containing protein 1) through yeast two hybrid system. Stub1 or CHIP (C-terminus of HSC70-interacting protein) is a cytoplasmic cochaperone which acts also as an E3-ligase. Therefore, it screens proteins either to their correct folding or degradation, being part of their quality control. The interaction between PrPC and CHIP was confirmed trough pull-down and coimmunoprecipitation assays. We also performed degradation tests and suggested that PrPC is a client protein of CHIP, since the last causes ubiquitination of PrPC. The present work aimed to enlighten in details the participation of CHIP in PrPC quality control. We carried out pull-down assays and saw that the N-terminal fraction of PrPC is not essential for its interaction with CHIP to happen, nor with Hsp90 and STI1, which suggests that these interactions occur through the C-terminal region of PrPC. Also, trough gene silencing tests and the use of a CHIP knocked out cell lineage, we saw that CHIP is capable of degrade PrPC. Furthermore, our ubiquitination assays suggested that this modulation happens through ubiquitin-proteasome system. If the conversion of PrPC to PrPSc depends of this quality control, CHIP presents itself as a potential target for therapeutic approaches in prion caused diseases. Thus, another approach of this work was to investigate if CHIP would be involved in the degradation of cytosolic forms of PrP (Cyt-PrP), since there is evidence indicating that these isoforms are toxic in certain cell types. Our group has already showed that, in cell viability assays, an increase of CHIP expression is able to reverse the toxic effects of Cyt-PrP. In the present work, we tried to better understand this protection mechanism of CHIP. When we used a plasmid capable of express a cytosolic form of PrP (Cyt-PrP), it was not possible to detect an interaction of this isoform of PrP and CHIP, through coimmunoprecipitation assays. In addition, Cyt-PrP was not degraded nor ubiquitinated by CHIP. This way, it is possible that CHIP acts indirectly on this form of PrP or even plays a chaperone activity to exert the observed protection effect. Once the characterization of PrPC metabolism helps to understand prion caused maladies, this work can cooperate in the evolution of treatment strategies for TSEs, having CHIP as a target. Keywords: PrPC. CHIP. Cytosolic prion. PrPC Quality control.