Mecanismo de ação da hispidulina sobre o metabolismo energético mitocondrial e análise comparativa das propriedades antioxidantes da hispidulina e eupafolina

Abstract

Resumo: Flavonoides são compostos derivados da benzo-y pirona extraídos de plantas que possuem inúmeros efeitos biológicos. Sua significância terapêutica toma importante a compreensão dos seus mecanismos de ação. Hispidulina (5,7,4'trihidroxi-6 metóxiflavona) e eupafolina (5,7,3',4'tetrahidroxi- 6 metóxiflavona), flavonas naturais que para este estudo foram extraídas das folhas de Eupatorium litoraíle, possuem propriedades antineoplásicas e antioxidantes já demonstradas, porém com mecanismos de ação ainda não descritos. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos da hispidulina sobre o metabolismo oxidativo de mitocôndrias de fígado de rato e suas propriedades antioxidantes, a fim de compará-las com a eupafolina. No que diz respeito à respiração mitocondrial, previamente foi demonstrado que a hispidulina (0,05-0,2 mol.l-1) reduziu a velocidade respiratória no estado III e estimulou-a no estado IV (ROCHA, 2000). As análises dos complexos da cadeia respiratória mostraram que a hispidulina inibe atividades enzimáticas entre os complexos I e III. A atividade da ATPase foi parcialmente inibida pela hispidulina quando foram utilizadas mitocôndrias intactas por congelamento e descongelamento, entretanto, esta flavona fortemente estimulou esta atividade em mitocôndrias intactas e nenhum efeito foi observado na presença de FCCP. A hispidulina foi classificada como um inibidor do transporte de elétrons, podendo atuar também como um desacoplador da fosforilação oxidativa. Nos experimentos de inchamento mitocondrial, na presença de glutamato e acetato de sódio, a hispidulina inibiu este parâmetro acentuadamente, em parte como consequência das inibições enzimáticas sobre a cadeia respiratória, porém a hispidulina parece não interferir com a membrana mitocondrial interna, como indiretamente demonstrado nos ensaios de inchamento mitocondrial na presença de valinomicina e KN03. No que diz respeito à liberação de ferro da ferritina, tanto a hispidulina quanto a eupafolina estimularam esta liberação em todas as concentrações utilizadas (0,05-0,2 mol.l-1), porém tal efeito foi mais acentuado para a eupafolina, e revertido pela catalase, o que sugere o envolvimento de H202 neste processo. Em relação às propriedades antioxidantes, a hispidulina foi incapaz de doar elétrons ao radical livre estável DPPH, por outro lado, a eupafolina reagiu com este radical de forma similar ao ácido ascórbico, usado como controle positivo. Os resultados acima sugerem que a inibição dos sistemas enzimáticos mitocondriais pela hispidulina podem ser os responsáveis pela sua citoxicidade e efeitos biológicos, e que os efeitos antioxidantes da eupafolina podem ser atribuídos ao seu anel catecoí, permitindo que esta atue como um bom agente redutor.

Abstract: Flavonoids are plant constituents that have important biological effects. Their potential therapeutic significance makes important an understanding of their action mechanisms. Hispidulin (6-methoxy-5,7,4'-trihydroxyflavone) and eupafolin (6-methoxy-5,7,3',4'- tetrahydroxyflavone), were extracted from leaves of Eupatorium litoralle, have recognized antioxidant and antineoplastic properties, although their mechanisms of action have not been described. We now study the effects of hispidulin on the oxidative metabolism of isolated rat liver mitochondria and their antioxidative properties in order to compare it to these of eupafolin. In terms of mitochondrial respiration, it was previously demonstrated that hispidulin (0.05-0.2 mmol-1) decreases the respiratory rate in state III and stimulated it in state IV (ROCHA, 2000). The enzymatic complexes showed that hispidulin caused a reduction of enzymatic activities between complexes I and III. Activity of ATPase was partially inhibited by hispidulin when mitochondria disrupted by freeze/thawing treatment was used. However, it strongly stimulated this activity in intact mitochondria and no effect was observed in the presence of FCCP. Hispidulin is classified as an electron-transport inhibitor, and as an uncoupler of oxidative phosphorilation. In mitochondrial swelling experiments, in the presence the glutamate and sodium acetate, hispidulin markedly inhibited this parameter, in part as a consequence of inhibition on enzymatic activities of the mitochondrial respiratory chain. However hispidulin seems not to interfere with the inner mitochondrial membrane, as indirectly demonstrated in assays of mitochondrial swelling in the presence of valinomycin and KN03. Both hispidulin and eupafolin release iron from ferritin at all concentrations used (0,05-0,2 mol.l-1), but this effect was more accentuated for eupafolin and reversed by catalase, suggesting that H2O2 is involved in this process. In terms of antioxidant properties, hispidulin was incapable of donating electrons to the stable free radical DPPH. On the other hand, eupafolin reacted with this radical similarly to ascorbic acid, used as a positive control. The results suggest that the inhibition of mitochondrial enzyme systems by hispidulin may be responsible for its cytotoxicity and biological effects, and that the antioxidant effects of eupafolin may be attributed to its catechol ring, that allows it to be a good reducing agent.